用于基因传递的多肽功能化天然高分子/碳酸钙杂化纳米粒子的制备

用于基因传递的多肽功能化天然高分子/碳酸钙杂化纳米粒子的制备 Preparation of Peptide Functionalized Natural Polymer/Calcium Carbonate Hybrid Nanoparticles for Gene Delivery first-author 吴聪，男，硕士生，现从事生物医用高分子研究．E-mail: 359011074@qq.com 吴聪，男，硕士生，现从事生物医用高分子研究．E-mail: 359011074@qq.com 359011074@qq.com corresp E-mail:chengsixue@whu.edu.cn E-mail:chengsixue@whu.edu.cn chengsixue@whu.edu.cn 武汉大学 化学与分子科学学院,湖北 武汉 430072 武汉大学 化学与分子科学学院,湖北 武汉 430072 College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 为了提高基因传递效率，本研究对用于基因传递的高分子/无机杂化纳米粒子进行了多肽功能化改性.利用生物素\亲和素（biotin\avidin）作用将同时具有肿瘤靶向性的精氨酸\甘氨酸\天冬氨酸（RGD）序列和细胞穿透功能的R8序列的生物素化多肽（biotinylated peptide，BP）修饰在具有良好生物相容性的生物素化肝素/鱼精蛋白/碳酸钙/DNA（HPB/PS/CaCO 3 /DNA）杂化纳米粒子表面，通过水溶液中的自组装方法制备得到了BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向基因传递纳米粒子.测量了其粒径和Zeta电位等，考察了该基因传递纳米粒子对HeLa细胞的转染效果.结果表明，BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA基因传递纳米粒子的水合粒径在175 nm左右，Zeta电位为负值；与未经多肽功能化的传递系统相比，该纳米粒子能更好地被细胞摄入，达到更高的转染效率，说明多肽功能化能提高杂化纳米粒子的基因传递效果；与商品化的基因转染试剂Lipofectamine 2000相比，该纳米粒子介导荧光素酶（pGL3-Luc）质粒在细胞中的表达水平明显较高. To improve the gene delivery efficiency, peptide functionalized polymer/inorganic hybrid nanoparticles for gene delivery were prepared in this study. A functional biotinylated peptide (BP) with a Arg\Gly\Asp (RGD) sequence for tumor targeting and a R8 sequence for enhanced cell uptake was introduced on the surface of heparin\biotin/protamine sulfate/calcium carbonate/DNA (HPB/PS/CaCO 3 /DNA) hybrid nanoparticles with ideal biocompatibility through biotin\avidin interaction. The peptide functionalized polymer/inorganic hybrid nanoparticles (BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA) for targeting gene delivery were prepared by self\assembly in an aqueous medium. The size and Zeta potential of the nanoparticles were measured. The in vitro gene transfections were carried out in HeLa cells, using pGL3-Luc as a reporter plasmid. The results show that BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA nanoparticles have a hydrodynamic size about 175 nm with a negative Zeta potential. As compared with the system without peptide functionalization, the peptide functionalized gene delivery system results in an increased cell uptake and enhanced transfection efficiency, demonstrating that the peptide modification can significantly enhance the gene delivery efficiency. The luciferase expression mediated by the peptide functionalized hybrid nanoparticles is higher than that mediated commercialized Lipofectamine 2000. 基因传递 纳米粒子 碳酸钙 鱼精蛋白 多肽 肿瘤靶向 gene delivery nanoparticles calcium carbonate protamine peptide tumor targeting 引 言 1 由于基因治疗在肿瘤等疑难疾病治疗中具有重要的意义，人们对基因传递载体的研究日益深入 [ 1 1 ~ 4 4 1~4 ] ，其中，靶向基因治疗(targeted gene therapy)作为一种能够将目的基因进行定向导入的智能模式更是倍受青睐 [ 5 5 ~ 7 7 5~7 ] .多肽是一类由氨基酸序列组成、具有生物活性的寡聚氨基酸，由于特定序列的多肽具有细胞穿膜、核定位和细胞靶向等不同的功能，多肽可作为靶向配体应用于传递系统中.由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的三肽RGD能特异性识别细胞表面的某些整合素，因此常被作为靶向配体来赋予传递载体肿瘤靶向功能 [ 8 8 ~ 15 15 8~15 ] .例如，Chen等 [ 16 16 ] 合成了同时含有RGD肽和R8穿膜肽的两亲性类BolA多肽，它自组装形成核壳结构能够与质粒DNA有效结合，对HeLa细胞和293T细胞均有良好的基因传递效果. 为了提高基因载体的传递效率，本研究用功能多肽修饰天然高分子/无机杂化纳米粒子，首先制备了具有良好生物相容性的生物素化肝素/鱼精蛋白/碳酸钙/DNA杂化纳米粒子(HPB/PS/CaCO 3 /DNA)，然后利用生物素-亲和素(biotin-avidin)作用将同时具有肿瘤靶向性的RGD序列和细胞穿透功能的R8序列的生物素化多肽(biotinylated peptide，BP)引入体系，制备得到BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向基因传递纳米粒子. 材料与方法 1 试剂与仪器 2 试剂：生物素化的肝素(HPB)和Avidin(12.8 U/mg protein)(Sigma-Aldrich公司)；氯化钙(CaCl 2 )、碳酸钠(Na 2 CO 3 )、二甲亚砜(DMSO)(分析纯，中国医药总集团)；MTT(分析纯，Amresco公司)；荧光染料Hoechst 33258、YOYO-1和Lipofectamine 2000(Invirogen公司)；BP(biotin GGGRRRRRRRRGDS)(吉尔生化公司)；硫酸鱼精蛋白(PS)(博美生化公司)；人宫颈癌细胞(HeLa)(中国典型培养物保藏中心)；DNA质粒pGL3-Luc(Promega公司).实验用水若无特别说明则为去离子水. 仪器：Zetasizer Nano ZS粒径分析仪(Malvern公司)，Bio-Rad 550酶标仪(Bio-Rad公司)，Berthold Lumat LB9507化学发光仪(Berthold公司)，Nikon Ni-E C2激光共聚焦显微镜(Nikon公司). BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子的制备 2 将16 μL CaCl 2 (0.5 mol·L -1 )溶液逐滴加入到10 μL含有1 μg DNA和0.05 μg HPB混合溶液中，加入23 μL水得到溶液A.将0.5 μg PS、16 μL Na 2 CO 3 (0.01 mol·L -1 )溶液和23 μL水混合得到溶液B.然后将A滴加至B中、均匀混合得到溶液C.向溶液C中依次加入0.67 μg Avidin、0.045 μg BP，得到含BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子的悬浮液.然后在10 000 r/min转速下离心5 min除去游离的Avidin和BP，离心后得到的纳米粒子用DMEM培养基再分散后用于后续实验. 粒径和Zeta电位的测定 2 纳米粒子的粒径分布和Zeta电位由粒径分析仪测量：100 μL含纳米粒子的悬浮液加900 μL水稀释后用于测量. 体外转染 2 将HeLa细胞用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基以5×10 4 /孔的密度种入24孔板中，于37 ℃，5%CO 2 环境中培养24 h，加入含纳米粒子的DMEM完全培养基，继续培养48 h后，移除培养基，用PBS缓冲溶液润洗2次，每孔加入200 μL细胞裂解液裂解并离心，取20 μL上清液与100 μL荧光素酶底物混合，用化学发光仪测定荧光素酶活性.用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测其蛋白浓度. 将1 μL的Lipofectamine 2000用超纯水稀释至50 μL，与50 μL含有1 μg DNA的溶液混合并孵育30 min得到Lipofectamine 2000/DNA复合物作为对照组. 细胞存活率测定 2 HeLa细胞经转染48 h后除去培养基，每孔加入1 mL新鲜DMEM完全培养基和60 μL MTT(5 mg·mL -1 )，37 ℃、5% CO 2 环境中继续培养，4 h后移除上清液，每孔加入850 μLDMSO并震荡，用酶标仪检测其在570 nm处的OD值. 细胞对纳米粒子的摄取 2 每μg pGL3-Luc质粒中加入2.5 μL YOYO-1(10 μmol·L -1 )溶液，放置15 min得到YOYO-1标记pGL3-Luc.然后用YOYO-1标记的DNA分别制备CaCO 3 /DNA，PS/CaCO 3 /DNA，HPB/PS/CaCO 3 /DNA以及BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子.将HeLa细胞用含有10% FBS的DMEM完全培养基以1×10 5 个/孔的密度种入6孔板中，37 ℃、5% CO 2 环境下培养24 h，然后加入200 μL含纳米粒子的培养基稀释液(含2 μg质粒DNA)，继续培养24 h后移除培养基，用PBS缓冲溶液润洗3次，然后用4%多聚甲醛37 ℃、5%CO 2 环境中固定15 min.再用PBS缓冲溶液润洗3次后加入Hoechst 33258(5 μg·mL -1 )培养15 min，用PBS缓冲溶液润洗3次.置于激光共聚焦显微镜下放大倍率400倍观察纳米粒子进入细胞及DNA在细胞内的分布情况. 结果与讨论 1 纳米粒子的制备机制 2 用共沉淀自组装法制备得到BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向基因传递纳米粒子.制备过程中，首先带正电荷的Ca 2+ 、PS与带负电荷的DNA、CO 3 2- 、HPB之间通过静电相互作用自组装形成HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子，随后HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子表面的生物素与加入的亲和素作用，形成Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA，之后再加入生物素化的多肽BP，最终形成BP/Avi-din/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向基因传递纳米粒子，结构如 图 1 图 1 所示.BP中RGD序列能通过与肿瘤细胞特异作用来提高传递效率，而R8序列利于细胞穿膜，可促进纳米粒子进入细胞. 表 1 表 1 为不同纳米粒子的组成及其粒径和Zeta电位.其中，Ca 2+ /CO 3 2- 的摩尔比为50/1，DNA的用量为1 μg以保证纳米粒子对DNA的有效负载，PS/HPB的质量比固定为10/1以保证带正电的PS和带负电的HPB有效结合.从 表 1 表 1 中看出，与PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子相比，HPB的加入使纳米粒子的粒径略有增加，而Avidin和BP的加入使纳米粒子的粒径略有减小.总的来说，各纳米粒子的粒径差别不大.此外，由于含带正电荷的PS [ 17 17 ] ，PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子的Zeta电位为正，而由于HPB带有较强的负电荷 [ 18 18 ] ，HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子带负电荷，而多肽功能化的BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子的Zeta电位为负值，这有助于该纳米粒子到达肿瘤部位，实现靶向基因传递. 纳米粒子 m PS /μg m HPB /μg m Avidin /μg m BP /μg 粒径/nm V Zeta /mV CaCO 3 /DNA - - - - 184±19 -1.9±0.2 PS/CaCO 3 /DNA 0.5 - - - 166±4 7.8±1.3 HPB/PS/CaCO 3 /DNA 0.5 0.05 - - 209±3 -10.0±0.9 BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA 0.5 0.05 0.67 0.045 175±15 -9.8±0.6 纳米粒子介导荧光素酶基因的表达 2 图 2 图 2 为用不同的纳米粒子处理48 h后HeLa细胞中荧光素酶的表达量.可以看出，靶向基因传递纳米粒子BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA与其他纳米粒子相比具有最高的转染效率，与商业化的Lipofectamine 2000相比转染效率高出约一个数量级.这是由于多肽BP中RGD序列的肿瘤靶向性和R8序列的细胞穿膜作用使得BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向纳米粒子能更高效地将目的基因导入肿瘤细胞，从而显著增强基因转染效率.需要指出的是，由于PS/CaCO 3 /DNA和HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子中含有促进穿膜和增强入核作用的PS，因此其基因表达也明显高于Lipofectamine 2000.即使和已具有良好基因传递效果的PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子相比，多肽功能化靶向基因传递纳米粒子BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA介导的基因表达水平也提高了近1倍. 细胞对纳米粒子的摄取 2 图 3 图 3 为不同纳米粒子转染24 h后HeLa细胞的共聚焦显微镜图.转染24 h后，含高分子组分的纳米粒子PS/CaCO 3 /DNA或HPB/PS/CaCO 3 /DNA处理后细胞中的绿色荧光(YOYO-1标记pGL3-Luc)较不含高分子的纳米粒子CaCO 3 /DNA处理后的细胞多，而靶向纳米粒子BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA处理的细胞中绿色荧光最强，说明多肽的肿瘤细胞靶向及细胞穿透作用使多肽功能化纳米粒子的基因传递效果最好.此外，从 图 3 图 3 中还可以看出，BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA处理的细胞中YOYO-1标记pGL3-Luc大量聚集在细胞核中，说明该靶向纳米粒子具有较强的基因传递能力，与荧光素酶的表达结果( 图 2 图 2 )相一致. 转染后HeLa细胞的存活率 2 图 4 图 4 为不同纳米粒子转染48 h后HeLa细胞的存活率.转染48 h后，经不同纳米粒子样品处理过的HeLa细胞存活率均在90%以上，表明所制备的4种纳米粒子均无明显的细胞毒性，能够作为理想的基因传递材料.这些纳米粒子无明显的细胞毒性是由于基因载体中的天然高分子和无机组分均具有良好的生物相容性的原因. 结 论 1 本研究利用生物素-亲和素作用将同时具有肿瘤靶向性的RGD序列和细胞穿透功能的R8序列的生物素化的多肽引入杂化纳米粒子基因传递体系，制备得到BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向纳米粒子.体外细胞转染实验表明，与HPB/PS/CaCO 3 /DNA纳米粒子相比，表面修饰了BP多肽的BP/Avidin/HPB/PS/CaCO 3 /DNA靶向纳米粒子对基因的传递效率及被HeLa细胞的摄取均有明显的提高，且该纳米粒子具有良好的生物相容性.这种多肽功能化的靶向基因传递纳米粒子在基因传递领域具有潜在的应用前景. 参考文献 ZHANG Y N, XIA J G, ZHANG Y J , et al. 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