表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组新城疫病毒耐热株的构建

表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组新城疫病毒耐热株的构建 Construction of the Recombinate Thermostable Newcastle Disease Virus Expressing Hemagglutinin Protein of H9 Subtype Avian Influenza Virus 1 2 first-author 胡潇，男，硕士生，现从事动物传染病疫苗研究. E-mail：578866095@qq.com 胡潇，男，硕士生，现从事动物传染病疫苗研究. E-mail： 578866095@qq.com 578866095@qq.com 2 2 2 2 1 corresp E-mail:zspan@whu.edu.cn E-mail:zspan@whu.edu.cn zspan@whu.edu.cn 武汉大学 生命科学学院/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072 武汉大学 生命科学学院/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072 College of Life Sciences/State Key Laboratory of Virology,Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China College of Life Sciences/State Key Laboratory of Virology,Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064 湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064 Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430064, Hubei, China Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430064, Hubei, China 应用反向遗传操作技术，将H9亚型禽流感病毒血凝素（HA）蛋白基因替换重组新城疫病毒耐热rTS-GFP/M株的绿色荧光蛋白基因，构建表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组新城疫病毒rTS-HA/M株.蛋白表达检测和病毒特性分析结果表明，该重组病毒能够在BHK-21细胞中高效表达HA蛋白，具有与亲本毒株类似的增殖能力、耐热特性和低致病性. To construct the recombinant newcastle disease virus (NDV) strain rTS-HA/M expressing the H9 subtype avian disease virus (AIV) hemagglutinin (HA) protein, the green fluorescence protein (GFP) gene in the recombinant NDV thermostable strain rTS-GFP/M was replaced by the H9-AIV HA gene using the reverse genetic technology. The HA expression of rTS-HA/M was analyzed by the immune-fluorescence assay and western blot, and the recombinant strain rTS-HA/M was characterized. The results demonstrated that the recombinant NDV strain rTS-HA/M efficiently expressed AIV-H9 HA protein in BHK-21 cells, and that the proliferation ability, thermostability and low pathogenicity of rTS-HA/M were maintained compared with its parental stain. H9亚型禽流感 新城疫病毒 耐热株 血凝素 二联疫苗 H9 subtype avian influenza virus newcastle disease virus thermostable strain Hemagglutinin protein bivalent vaccine 引言 1 禽流感和新城疫是危害我国养禽业的重大传染病 [ 1 1 , 2 2 ] ，分别由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)感染引起.H9亚型属于低致病性禽流感病毒，感染鸡群的直接致死率不高，但其传播快，可破坏鸡群免疫系统，并继发大肠杆菌等病原菌感染，进而造成高死亡率 [ 3 3 ] .禽流感病毒基因组由8个分节段的单股负链RNA组成，编码12种以上的病毒蛋白.其中，血凝素(hemagglutinin，HA)是包膜糖蛋白和主要的抗原蛋白，可诱导机体产生特异性体液免疫应答 [ 4 4 ] ，是研制基因工程疫苗的重要抗原蛋白.新城疫病毒是副粘病毒科副粘病毒属成员，基因组为单股负链RNA.近年来以新城疫病毒为载体表达其他抗原基因构建基因工程双价或多价疫苗已成为疫苗发展的热点.重组NDV成功表达的外源蛋白包括：传染性法氏囊病毒VP2蛋白 [ 5 5 ] 、H5亚型禽流感病毒HA蛋白 [ 6 6 ] 、狂犬病毒G糖蛋白 [ 7 7 ] 、严重急性呼吸综合征病毒CoV蛋白 [ 8 8 ] 、人类免疫缺陷病毒Gag蛋白 [ 9 9 ] 等，表达外源蛋白的重组NDV均能在体内诱导特异性免疫应答 [ 10 10 ] .这些重组病毒一般以没有耐热特性的NDV LaSota株或Clone-30株等为骨架构建，热稳定性差，对冷藏条件要求高.NDV毒株中的V4、I-2、HB92和TS09-C株等具有耐热特性 [ 11 11 ] ，可用于制备具有耐热、低毒、高效、接种方便等优点的重组新城疫疫苗. 本研究以表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的NDV弱毒耐热株rTS-GFP/M为亲本毒株 [ 12 12 , 13 13 ] ，利用反向遗传操作技术，构建了表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组病毒株rTS-HA/M，并对HA蛋白的表达、重组病毒的生物学特性进行研究，旨在为研发抗新城疫和H9亚型禽流感的基因工程二联耐热活疫苗奠定基础. 材料与方法 1 材料及试剂 2 材料：禽流感病毒H9N2毒株A/Chicken/Hubei/C1/2007、BHK-21细胞、表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3、NDV感染性克隆pTS-GFP/M和辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P、pcDNA-L均由本实验室保存；SPF鸡胚购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司. 试剂：dNTPs、反转录酶、DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；rTaq酶、PrimerSTAR HS DNA Polymerase和DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；磷酸钙转染试剂盒购自Invitrogen 公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；鸡抗NDV 阳性血清和鸡抗H9亚型禽流感病毒阳性血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鸡IgYG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase购自Agilent公司；In-fusion clone kit购自Clontech公司. 引物设计 2 根据pTS-GFP/M全长质粒序列和H9N2毒株 HA 基因序列设计引物，如 表 1 表 1 所示. 引物 引物序列(5′-3′) 用途 HA-F ATGGAAACAGTATCACTAATAAC 2 RT-PCR扩增HA基因 HA-R TTATATACAAATGTTGCATCTGC 18T-HA-F ATGGTGAGCAAGGGCATGGAAACAATATCACTAATAGCTATACTACTA 扩增HA基因，用于 18T-HA-R AAAGTTACCCATGGCTATACAAATGTTGCATCTGCAAGAT In-fusion克隆连接 pTS-M-F GCCATGGGTAACTTTGACCTTCT 扩增载体大片段，用于 pTS-M-R GCCCTTGCTCACCATCAG In-fusion克隆连接 全长感染性克隆pTS-HA/M质粒和重组病毒构建 2 将H9N2毒株A/Chicken/Hubei/C1/2007在SPF鸡胚上连续扩增3代，使用Axygen RNA试剂盒提取病毒基因组RNA，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增病毒HA基因，克隆到pMD-18T载体，获得重组质粒pMD-HA，测序鉴定. 分别以pMD-HA和pTS-GFP/M为模板扩增HA片段和pTS-M片段，扩增片段通过In-fusion连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，经酶切消化和测序鉴定，重组质粒命名为pTS-HA/M. 将重组质粒pTS-HA/M和辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P、pcDNA-L通过磷酸钙法共转染预先感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞.转染6 h后，细胞更换为含0.2 μg/mL TPCK-胰酶的无血清的DMEM培养基继续培养.待转染细胞出现病变后，反复冻融3次，离心收获细胞裂解液，经0.22 μm滤膜过滤除去痘病毒，接种9~11日龄SPF 鸡胚，于37 ℃孵化5 d，收集鸡胚尿囊液，测定HA活性.挑选HA阳性的病毒液进行RT-PCR、测序鉴定，筛选获得重组NDV病毒，命名为rTS-HA/M株. 间接免疫荧光染色 2 将重组病毒rTS-HA/M和对照rTS09-C毒株分别感染BHK-21细胞，培养36 h，用80%丙酮固定细胞20 min，分别用鸡抗NDV阳性血清(1∶200) 和鸡抗H9亚型禽流感阳性血清(1∶200) 为一抗，以兔抗鸡IgYG-FITC (1∶200) 为二抗免疫荧光染色，于倒置荧光显微镜下进行观察. Western blot分析HA蛋白表达 2 重组病毒rTS-HA/M株感染BHK-21细胞，培养36 h，弃去培养液，裂解并收集细胞，Western blot分析.首先将样品进行SDS-PAGE电泳，再将电泳分离的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上，依次以H9亚型禽流感阳性鸡血清(1∶200) 为一抗、HRP-羊抗鸡抗体(1∶10 000) 为二抗进行反应，用二氨基联苯胺底物显色，记录结果. 重组病毒的生长特性分析 2 将重组病毒rTS-HA/M进行10倍系列梯度稀释，分别感染BHK-21细胞，记录细胞病变，按照Reed-Muench公式计算病毒的半数组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCI D 50 ) [ 14 14 ] .将重组病毒以100 TCI D 50 感染BHK-21细胞，分别于感染后24、48、72和96 h收集细胞培养上清液，测定TCI D 50 值，绘制重组病毒生长动力学曲线. 重组病毒的耐热特性和致病性测定 2 将重组病毒rTS-HA/M株病毒液置于56 ℃水浴锅中进行热处理，每隔一定时间取出病毒液，测定HA效价；将热处理后的重组病毒分别接种BHK-21细胞，持续观察细胞病变3~5 d. 将重组病毒rTS-HA/M进行10倍系列梯度稀释，每个稀释度接种4枚鸡胚，于37 ℃孵育，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d，每天记录鸡胚死亡情况.以能够引起鸡胚全部死亡的最高稀释度病毒为最小致死量，计算重组病毒鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD). 结果 1 重组嵌合NDV基因组全长cDNA克隆的构建 2 采用特异性引物PCR分别扩增H9亚型禽流感病毒HA基因和载体片段pTS-M，目的片段大小均与预期相符；将HA基因与pTS-M片段通过In-fusion连接，构建重组含HA基因的嵌合NDV基因组全长cDNA克隆质粒pTS-HA/M( 图 1A 图 1A ).质粒pTS-HA/M经限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Mlu Ⅰ酶切鉴定，片段大小与预期一致( 图 1B 图 1B ). 2AUbi：包含有口蹄疫病毒2A基因和泛素基因的融合片段；3349：代表GFP插入在NDV基因组的起始核苷酸位点；M：DL15000 DNA Marker；1： BamH Ⅰ内切酶消化；2： Mlu Ⅰ内切酶消化 2AUbi:the fused fragment containing the foot-and-mouth disease 2A gene and ubiquitin gene;3349:the exact nucleotide position in the NDV genome where the GFP gene was inserted;M：DL15000 DNA Marker;1: BamH Ⅰ digestion;2: Mlu Ⅰ digestion 重组病毒拯救和HA表达分析 2 采用磷酸钙法将重组质粒pTS-HA/M和辅助质粒共转染至感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞，待出现细胞病变时，收获细胞培养上清液，用0.22 μm滤膜过滤，接种9~11日龄SPF鸡胚，鸡胚尿囊液经血凝实验(HA)检测为阳性.取HA检测阳性的鸡胚尿囊液，提取总RNA，通过RT-PCR扩增得到了大约1.8 kb的条带( 图 2A 图 2A )，与预期的 HA 基因大小一致. (A) 重组病毒基因组HA基因片段扩增，M:DL2000 DNA Marker,1:HA片段扩增；(B)重组病毒的间接免疫荧光染色(IFA)检测；(C) Western blot检测重组病毒在BHK-21细胞中的HA蛋白表达，M:蛋白Marker；1:rTS-HA/M感染BHK-21细胞；2:rTS09-C感染BHK-21细胞 (A) PCR amplification of H9-AIV HA gene from the NDV rTS-HA/M. M:DL2000 DNA Marker,1:Amplification of HA gene from rTS-HA/M;(B)IFA analysis of HA protein expression of rTS-HA/M in BHK-21 cells;(C)Western blot analysis of HA protein expression of rTS-HA/M in BHK-21 cells,M:Prestained protein Marker;1:BHK-21 cells infected with rTS-HA/M;2:BHK-21 cells infected with rTS09-C 重组病毒尿囊液感染BHK-21细胞，免疫荧光染色观察( 图 2B 图 2B )证实，对照病毒rTS09-C株感染BHK-21细胞能被抗NDV抗体染色，与抗HA抗体无反应；重组病毒rTS-HA/M株感染的BHK-21细胞中能同时检测到NDV蛋白和HA蛋白的表达. 重组病毒rTS-HA/M株感染BHK-21细胞Western blot分析结果( 图 2C 图 2C )显示，与H9-AIV阳性血清反应的阳性条带大小约61 000，与预期相符，表明重组病毒rTS-HA/M株在BHK-21细胞中表达HA蛋白. 重组病毒rTS-HA/M的特性 2 重组病毒特性分析显示，表达HA蛋白的重组病毒rTS-HA/M株与对照病毒rTS09-C株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性，两株病毒均在96 h达到峰值滴度，分别为10 7 ，10 6.7 TCI D 50 /mL( 图 3 图 3 ). 比较重组病毒rTS-HA/M、对照病毒rTS09-C株和非耐热NDV病毒Lasota株热稳定性发现， Lasota株在56 ℃条件下9 min即失去血凝活性；对照病毒rTS09-C株和重组病毒rTS-HA/M株经56 ℃处理90 min仍具有血凝活性，且能够感染BHK-21细胞. 重组病毒rTS-HA/M鸡胚致病性测定结果显示，按照国际兽疫局(O.I.E)的标准，rTS-HA/M株感染鸡胚的MDT/MLD值大于120 h，为低致病性，仍保持NDV弱毒株特性. 结论 1 以NDV弱毒疫苗株为载体表达外源蛋白，采用反向遗传操作技术研制同时预防多种禽病的多联(价)活疫苗，是禽类疫苗研发的热点之一.本研究以表达GFP的重组NDV耐热rTS-GFP/M株为骨架，将H9亚型禽流感病毒HA基因插入到NDV基因组P和M基因之间，获得重组病毒rTS-HA/M株.该重组病毒能够有效表达HA蛋白.Carnero等 [ 15 15 ] 将人类免疫缺陷病毒(HIV)的 gag 基因分别插入到NDV低毒力毒株Hitchner B1的6个结构基因转录起始位点前，发现 gag 基因插入到NDV基因组P和M之间时对病毒在Vero细胞上的增殖影响最小.同样，本研究发现外源基因HA插入到NDV基因组P和M之间并未影响病毒在BHK-21细胞上的增殖特性.重组病毒rTS-HA/M保持了亲本株的耐热等特性.有报道 [ 16 16 ] 推测V4株的热稳定性可能与其HN蛋白的第403位氨基酸缺失有关，或与L基因有关.我们最近发现，NDV的耐热性与HN蛋白结构有关，这尚需进一步的研究.同时，研究重组病毒rTS-HA/M株的遗传稳定性、免疫接种诱导鸡群抗病毒保护效力也是下一步重点探讨的工作. 参考文献 MILLER P J, GUUS K. 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