TaqMan实时荧光定量PCR检测外周血中survivin

TaqMan实时荧光定量PCR检测外周血中 survivin Detection of surivin in Peripheral Blood Using a TaqMan Real-Time Fluorescent Quantitative PCR first-author 齐自慧, 女, 硕士生，现从事医学分子诊断学研究. E-mail:2013282040163@whu.edu.cn 齐自慧, 女, 硕士生，现从事医学分子诊断学研究. E-mail: 2013282040163@whu.edu.cn 2013282040163@whu.edu.cn corresp E-mail:wangyefu@whu.edu.cn E-mail:wangyefu@whu.edu.cn wangyefu@whu.edu.cn 武汉大学 生命科学学院/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072 武汉大学 生命科学学院/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072 College of Life Sciences/State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China College of Life Sciences/State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 通过TaqMan实时荧光定量PCR（聚合酶链式反应），建立一种快速检测凋亡抑制蛋白 survivin 基因的特异检测方法.选择 survivin 基因的保守序列设计引物和对应的探针，经PCR扩增95 bp序列，经pES1002质粒克隆后转入大肠埃希氏菌 E. coli DH5α，提取重组质粒，鉴定后作为模板制作TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线，然后进行方法的重复性和灵敏度实验.结果表明，该检测方法能够检测外周血 survivin 基因，线性范围为1×10 7 ~1×10 4 copies/μL，相关系数为0.998，灵敏度为1×10 2 copies/μL. This work aims to develop a fast, sensitive and specific method for the detection of survivin in peripheral blood using the TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) method. Based on the conserved sequence of survivin , primers and probe were designed. And then, a PCR assay was established. The 95 bp fragment was amplified and cloned into pES1002 vector which was subsequently transformed into E. coli DH5α. After being extracted and identificated, recombinant plasmid was used as quantitative template to generate standard curve. Reproducibility and specificity of the assay was determined as well. The results demonstrated that the linear range of the standard curve was 1×10 7 -1×10 4 copies/μL, and the correlation coefficient was 0.998, the sensitivity was 1×10 2 copies/μL. TaqMan实时荧光定量PCR survivin 肿瘤 外周血 TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR survivin tumor peripheral blood 引言 1 凋亡抑制蛋白 survivin 在正常成人组织中低表达或者不表达，但在肿瘤患者中会大量表达 [ 1 1 ] ，不同癌症外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)中均具有较高的 survivin 基因检出率 [ 2 2 - 5 5 2-5 ] .因此， survivin 基因已经成为一种新的肿瘤标志物 [ 6 6 - 9 9 6-9 ] ，该基因的检测对于癌症的提前诊断、疗效评估和预后研究具有较高的临床价值. survivin 基因的检测方法多样，如放射免疫分析技术 [ 10 10 ] 、酶联免疫分析技术 [ 11 11 ] 以及化学发光免疫分析技术 [ 12 12 ] 等.这些技术都具有较高的灵敏度和特异性，但也存在不同程度的缺陷，如放射免疫分析技术需要放射性标记，不够安全，酶联免疫分析技术易出现假阳性，而化学发光免疫分析技术在研究和生产上难度较大等.PCR(聚合酶链式反应)技术具有取材量小，对病人造成的伤害小，且操作安全简便，检测快速等优点.目前，研究人员已通过PCR方法发现 surivin 基因能够在大多数的恶性肿瘤(如肝癌 [ 13 13 ] 、胰腺癌 [ 14 14 ] 、胃癌 [ 15 15 ] 等)中高表达.TaqMan实时荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上利用Taq酶5′→ 3′外切酶活性和荧光共振能量转移的原理，可对PCR反应进行实时监控，灵敏度和特异性高，检测用时短，且无需PCR后处理，避免了污染，检测样本用量少，能够实现精准定量 [ 16 16 ] .已有文献报道 [ 17 17 ] 利用SYBR Green染料法进行荧光定量PCR实验，染料法会出现非特异性结合.而TaqMan法因为探针具有特异性，不会出现非特异性扩增，特异性和敏感性也更高.目前，TaqMan荧光定量PCR法已被广泛应用于病毒、细菌的检测，如丙肝病毒 [ 18 18 ] 、轮状病毒 [ 19 19 ] 、革兰阴阳性细菌 [ 20 20 ] 等. 本实验旨在用TaqMan实时荧光定量PCR技术构建癌症患者外周血中 survivi n基因的检测方法. 材料与方法 1 材料、试剂及仪器 2 材料：本实验所用样本由湖北省肿瘤医院、湖北省中医院、武汉大学附属中南医院、武汉大学校医院提供. 试剂：SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；TRNzol-A+总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；限制性内切酶 EcoR Ⅰ， BamH Ⅰ，Taq酶系列、RRI RNA酶抑制剂、OligodT (18) (TaKaRa 公司)；M-MLV逆转录酶(Promega公司). 仪器：ABI7500型荧光定量PCR检测仪(美国应用生物系统公司)；MJ-Mini TMPCR型扩增仪(Bio-Rad公司)；5424R型高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司)；FR-980型凝胶成像仪(上海复日科技)；Quawell TM型超微量紫外可见分光光度计(Q5000) (北京华大中生科技发展有限公司). 实验方法 2 样品处理 3 所有样品均按照TRIzol-A+试剂盒的使用说明提取总RNA，然后将RNA反转为cDNA. 逆转录体系为25 μL，其中：5 μL反应缓冲液，1 μL 200 U/μL M-MLV逆转录酶，1.25 μL 10 mmol/L dNTPs，2 μL随机引物OligodT (18) ，0.5 μL 40 U/μL的RNase抑制剂，10 μL RNA模板，加无RNA酶水至总体积25 μL.以上体系的反应程序为42 ℃ 1 h，60 ℃ 10 min. -20 ℃保存逆转录产物. 引物与探针设计 3 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)检索( http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.ncbi.nlm.nih.gov )，获得在多种肿瘤病人中均可检测到的野生型 survivin 基因(NCBI检索号:BC065497.1) 及其剪接变异体 survivin -△Ex3(NM_001012270.1) ， survivin -2B(NM_001012271.1) ， survivin -2α(AY927772) 和 survivin -3B(DQ227257.1) 等序列，用MEGA 4.0软件进行比对，找到保守序列.根据 survivin 基因保守序列进行引物探针的设计，用BeaconDesigner 7.0软件设计普通TaqMan探针及引物.所有引物探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成. survivin 保守序列(PCR产物共95 bp)： 5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTC-TTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGG-ATGGCCGAG-3′ 引物及探针序列如下： 上游引物：5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCA-3′ 下游引物：5′-CTCGGCCATCCGCTCC-3′ 探针：5′-(FAM)-CCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCC-(BHQ-1) -3′ 常规PCR产物回收克隆及鉴定 3 PCR反应体系为50 μL，其中：PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L Mg 2+ 7 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL，加灭菌双蒸水至总体积为50 μL.PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，之后再于72 ℃反应5 min.其产物经2%琼脂糖凝胶电泳，DNA 胶回收试剂盒回收.将回收片段克隆至PES载体上，构建重组质粒，转化入DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素(Amp + ) 的LB平板上进行蓝白斑筛选，提取质粒并用PCR (反应体系和反应条件同上) 鉴定,然后送上海英骏生物技术公司测序. TaqMan实时荧光定量PCR反应条件 3 为提高反应的扩增效率与灵敏度，选择1×10 4 ,1×10 5 ,1×10 6 ,1×10 7 copies/μL 4个浓度的重组质粒为检测样品，反应体系为50 μL.首先进行条件优化：Mg 2+ (25 mmol/L)的加入量(μL)分别为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；引物与探针(均为10 mmol/L)加入量(μL)分别为(1.3,0.6) ，(1.4,0.8) ，(1.5,1) ，(1.6,1.2) ，(1.7,1.4) 5个梯度.采用双因素混合水平正交实验设计实验.最后对Taq酶进行优化实验：Taq酶(5 U/μL)加入量(μL)分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0.反应过程分两个阶段，第一阶段：37 ℃ 5 min，94 ℃ 5 min；第二阶段：94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s(收集荧光)，72 ℃ 20 s，共40个循环. 通过以上优化实验确定反应体系中Mg 2+ 、引物和探针以及Taq酶的最适用量. 标准曲线的建立 3 选择1×10 7 ～1×10 4 copies/μL 4个浓度的重组质粒为模板，在最佳反应条件下进行TaqMan实时荧光定量PCR实验，制作标准曲线. 重复性实验 3 采用最优体系进行重复性实验，选择1×10 7 ～1×10 4 copies/μL 4个浓度梯度的重组质粒为模板，每个反应进行3次平行实验.通过扩增荧光曲线和循环阈值(Ct)计算来确定该反应重复性. 特异性和灵敏度实验 3 选择1×10 4 ～1×10 1 copies/μL的重组质粒为模板，每个质粒浓度进行3次平行实验，以出现较好的S型曲线、最大Ct值不超过35的最低浓度为检测灵敏度. 临床样本检测 3 采集20例癌症患者新鲜血液和50例健康体检者的新鲜血液2 mL.所有癌症患者血液在术前采集并且未经过放化疗.其中，癌症患者包括7例肝癌患者，6例宫颈癌患者，5例胃癌患者和2例乳腺癌患者.50例无既往病史的健康者作为对照组.采血过程中为防止污染，外周血样品通过插入外围容器中的导管获得，并且丢弃最初的5 mL血液.这项研究经伦理委员会监控. 利用已优化的体系对外周血样品进行TaqMan实时荧光定量PCR实验. 结果与讨论 1 重组质粒筛选和鉴定 2 重组质粒经常规PCR、2%琼脂糖凝胶电泳，得到95 bp的条带( 图 1 图 1 )，经测序结果显示，序列与1.2.2 节中最终确定的保守序列相同. 1：Maker；2：重组质粒PCR产物；3：阴性对照 1:Maker;2:PCR product of the recombinant plasimd;3:Negative control TaqMan实时荧光定量PCR最佳反应条件 2 通过优化实验，50 μL反应体系的最佳反应条件为：Mg 2+ (25 mmol/L)7 μL，终浓度3.5 mmol/L；上下游引物(10 mmol/L)1.3 μL，终浓度0.26 mmol/L；探针(10 mmol/L)1 μL，终浓度0.2 mmol/L；Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，终浓度2U. 标准曲线 2 根据最佳反应条件，以1×10 7 ，1×10 6 ，1×10 5 ，1×10 4 copies/μL 4个浓度的重组质粒为模板，进行TaqMan实时荧光定量PCR实验，扩增曲线如 图 2(A) 图 2(A) 所示，标准曲线如 图 2(B) 图 2(B) 所示.标准曲线 y =-3.422 x +36.56，相关系数0.998，线性范围1×10 7 ~1×10 4 copies/μL. 重复性 2 重复性实验采用变异系数CV(%)进行方法重现性评价( 表 1 表 1 ). 表 1 表 1 中3次循环的Ct值较为接近，且CV值均在5%以下，表明本实验方法的实验结果稳定，重复性良好. 2 c /copies·μL -1 3 Ct 2 CV/% 1 2 3 1×10 7 8.43 8.97 9.69 3.11 1×10 6 12.44 12.15 11.79 3.43 1×10 5 15.37 15.72 16.38 4.05 1×10 4 20.76 20.61 19.45 4.41 特异性和灵敏度 2 将重组质粒作为标准品进行普通PCR扩增，然后将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳图显示各泳道在95 bp的位置均有特异性条带出现，阴性对照无条带出现.将PCR产物测序，所测序列与靶序列完全一致，未出现非特异性扩增产物. 此外，选择浓度为1×10 4 ，1×10 3 ，1×10 2 ，1×10 1 copies/μL的标准品进行荧光定量PCR实验，结果如 图 3 图 3 所示，相对应的循环阈值如 表 2 表 2 所示.除1×10 1 copies/μL对应的曲线外，其余3条曲线的Ct值均小于35，且呈现出明显的S型.据此，本实验设定Ct值在35个循环之内，检测结果低于1×10 2 copies/μL的样品为阴性标本. c /copies·μL -1 Ct 1×10 4 27.56 1×10 3 31.18 1×10 2 34.65 1×10 1 38.09 目前，大多数的荧光定量PCR用的是染料法，所测 survivin 的最高灵敏度也可以达到1×10 2 copies/μL [ 21 21 ] .但是该文献方法是一种相对定量的方法，得到的结果是相对于内参的拷贝数量.而TaqMan实时荧光定量PCR是一种绝对定量的方法，故本实验的灵敏度好. 临床样品检验结果 2 用已建立的TaqMan实时荧光定量PCR体系检测临床外周血样品，50例健康样本中 survivin 检测结果为3例为阳性(占6%)，其中1例为强阳性，2例为弱阳性；20例癌症样本中 survivin 检测结果为15例为阳性(占75%)，5例为阴性.其中15例阳性样本包括：肝癌样本5例(占71%)，宫颈癌4例(占67%)，胃癌4例(占80%)，乳腺癌2例(占100%). 结论 1 本研究运用TaqMan实时荧光定量PCR技术实现了对 survivin 基因的快速、灵敏地检测，且检测特异性高.在采集血液时弃去前5 mL血液，有效地解决了实验结果出现假阳性的问题.该方法操作简便，仅需抽取少量外周血，能在对病患最低伤害的情况下快速获得准确的检验结果，可望应用于临床上癌症的早期诊断、疗效评估等方面.但由于样本数量限制，本文结果还有待进一步大量临床样本进行验证. 参考文献 PAVOIDOU A, KROUPIS C, DIMAS K, et al. 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