运用代谢途径间Crosstalk提高 Neocarazostatin A产量

运用代谢途径间Crosstalk提高 Neocarazostatin A产量 Production Improvement of Neocarazostatin A by Utilizing the Crosstalk between Metabolic Pathways first-author 钟琇, 女, 硕士生，现从事微生物天然产物生物合成研究. E- mail: zhongxiu0625@126.com 钟琇, 女, 硕士生，现从事微生物天然产物生物合成研究. E- mail: zhongxiu0625@126.com zhongxiu0625@126.com corresp E- mail:yu_yi@whu.edu.cn E- mail:yu_yi@whu.edu.cn yu_yi@whu.edu.cn 武汉大学 药学院/组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，湖北 武汉 430071 武汉大学 药学院/组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，湖北 武汉 430071 Key Laboratory of Combinatory Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education/ School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China Key Laboratory of Combinatory Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education/ School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 三环咔唑生物碱Neocarazostatin A和萜类化合物二甲基异冰片(2- methylisoborneol, 2- MIB)均以异戊二烯焦磷酸(IPP)为前驱体完成生物合成.本文通过敲除链霉菌 Streptomyces sp. MA37中2- MIB基因簇( ma_mib 2)的 CDS 14基因，使前驱体IPP流向Neocarazostatin A的生物合成途径，以提高其产量.结果显示，2- MIB合成基因簇的同框缺失突变株丧失了2- MIB的产生能力，同时Neocarazostatin A产量明显提高，表明Neocarazostatin A和2- MIB的生物合成途径间存在Crosstalk(交叉对话). Isoprenyl pyrophosphate (IPP) is the common precursor for the biosynthesis of both tricyclic carbazole alkaloid Neocarazostatin A and terpene compound 2- methylisoborneol (2- MIB). In order to improve the yield of Neocarazostatin A in the host strain, we knocked out the gene of CDS 14 (which is in ma_mib2 , the biosynthesis gene cluster of 2- MIB) to direct the metabolic flux of IPP to the pathway of Neocarazostatin A. The results showed that the ma_mib 2 in- frame deletion mutant of Streptomyces sp. MA37 lost the ability of producing 2- MIB, while the yield of Neocarazostatin A increased significantly in the mutant. Therefore, there exists the crosstalk between the metabolic pathways of Neocarazostatin A and 2- MIB. 三环咔唑生物碱 Neocarazostatin A 异戊二烯 生物合成 基因敲除 交叉对话 tricyclic carbazole alkaloid Neocarazostatin A isoprene biosynthesis gene knock- out Crosstalk 引言 1 Neocarazostatin A属三环咔唑生物碱 [ 1 1 ] ，于1991年从土壤链霉菌 Streptomyces sp. GP 38菌株的培养物中分离得到，对由自由基诱导引起的小鼠脑组织匀浆脂质过氧化症状(lipid peroxidation)有强烈抑制作用 [ 2 2 ] ，可用于治疗心肌和大脑的局部缺血 [ 3 3 , 4 4 ] 、动脉硬化 [ 5 5 ] 以及炎症 [ 6 6 ] .Neocarazostatin A具有良好的自由基清除功能，对大脑脂质过氧化抑制作用的半抑制浓度(IC 50 )远低于氟桂利嗪(Flunarizine)和羟基甲苯二丁酯(Butylhydroxytoluene)等用于大脑保护的临床药物，极有潜力发展成为自由基清除先导药物的母核 [ 2 2 , 7 7 , 8 8 ] .然而，该化合物在野生型菌株中的产量不足100 mg/L，难以实现开发利用. 20世纪90年代日本科学家通过同位素标记实验，首次证实了Carbazomycin B及Carquinostatin B 中完整碳骨架的生物合成前驱体 [ 9 9 ] .基于Neocarazostatin A与Carbazomycin B结构的高度相似性，本课题组运用基因组扫描的方法定位了Neocarazostatin A的生物合成基因簇 [ 10 10 ] ，并推导了Neocarazostatin A( 图1 图1 )可能的生物合成途径：以色氨酸(tryptophan)为前驱体，通过与丙酮酸缩合加载2C单元，经一系列反应拼合出Neocarazostatin A骨架，然后在异戊烯转移酶的作用下在中间体的C6位加载异戊烯基 [ 11 11 , 12 12 ] ，完成Neocarazostatin A分子的组装.但由于Neocarazostatin A在 Streptomyces sp. MA37(MA37)菌株中产量较低，极大影响后期对其生物合成机理的深入研究. 不同化合物在代谢途径间相互影响的现象称为Crosstalk [ 13 13 ] ，Qin等 [ 14 14 ] 已发现actinomycin G与phenazinomycin两种化合物的合成过程中存在Crosstalk现象.在 Streptomyces iakyrus 菌株中，将actinomycin G的生物合成基因 acmG 5′敲除后，该突变型菌株表达出另一种化合物phenazinomycin.由此推断，基因 acmG 5′的失活导致phenazinomycin产量的提升是因为分支酸的竞争作用，而分支酸是actinomycin G和phenazinomycin这两个不相关的天然产物合成通路中共用的前驱体. 在对MA37进行基因组挖掘的过程中，发现由 CDS 12， CDS 13， CDS 14三个基因组成的 ma_mib 2基因簇与已知的萜类化合物的生物合成基因簇很相似，进一步比对可知，其为萜类化合物二甲基异冰片(2-methylisoborneol，2-MIB)的合成基因簇 [ 15 15 ] .而萜类化合物在生物体内是由异戊二烯衍生而来，因此，Neocarazostatin A和2-MIB的生物合成途径之间会竞争异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)进行生物合成 [ 16 16 ] .基于这一Crosstalk现象，本实验拟通过调节IPP的代谢流来提高Neocarazostatin A的产量. 实验部分 1 材料及仪器 2 菌株、质粒和引物 3 本实验所用菌株、质粒和引物见 表1 表1 和 表2 表2 ，所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成. 菌株/质粒 特征 来源 菌株 E. coli DH10B F - 依赖，基因型为：recA1,lacZ,ΔM15 本实验室收藏 E. coli ET12567/pUZ8002 DNA非甲基化宿主，用于 E.coli 和链 霉菌之间接合转移 本实验室收藏 MA37 Neocarazostatin A产生菌株 英国阿伯丁大学海洋天然产物 研究中心邓海教授提供 WDY612 ma_mib 2同框缺失突变株 本实验中构建 质粒 pKC1139 温敏型载体， E.coli 和链霉菌的穿梭型载体，可 用于使基因失活 本实验室收藏 pWDY612 ma_mib 2同框缺失质粒 本实验中构建 引物 序列(5′-3′) 功能 pWDY612-left-F GCCTACTGGGACACCCACCGGAACGACAGCGTCAACCTGGA TATCATTCCGGGGATCCGTCGACC ma_mib 2同框缺失菌株的构建 pWDY612-right-F CCGCCTGGCCACCCCGCCCGCGCCCGTCACATCTACACCG ma_mib 2同框缺失菌株的构建 pWDY612-right-R CGCCTCTTCGATGCCGGTCGCCAGGGAGGACCTGGCGCGG ATATCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC ma_mib2 同框缺失菌株的构建 pWDY612-left-R GGGGTGGCCAGGCGGCCTGGCTCTCGCCGTCGCGGCGGAG ma_mib 2同框缺失菌株的构建 pWDY612-ID-F GCAACCACGCCTGGCACCAG WDY612验证 pWDY612-ID-R CAGCCCACCGAACTGATCGA WDY612验证 CDS12-left GGCAAGGTGGACAGGACCGGGACCGGCG Reverse Transcription PCR(RT-PCR) CDS12-right GGGGGTCGCCGCGGTGAACGTGAACTCCC RT-PCR CDS13-left CCGGATCCCGCCTCGGGATCACCGCCGCC RT-PCR CDS13-right GGCCAGGCGGGCCAGGTGCTCGACCGCGG RT-PCR CDS14-left CCGACCTGCTGCTGGACCACCTCGAGCCGC RT-PCR CDS14-right GCCGGTTGGCGAAGCCCACCTGGTACTCGG RT-PCR 主要试剂与仪器 3 试剂包括限制性内切酶(TaKaRa公司)、一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)、KOD DNA 聚合酶(Toyobo公司)、DNA marker及Taq DNA聚合酶(东盛生物科技有限公司)、In-Fusion HD 质粒克隆试剂盒(Clontech 公司)、凝胶回收试剂盒(Omega公司)、质粒提取试剂盒(Omega公司)、抗生素氨苄青霉素(Ampicillin,Sigma公司，使用浓度50 μ g/mL)、卡那霉素(Kanamycin,Sigma公司，使用浓度25 μ g/mL)、氯霉素(Chloramphenicol,Sigma公司，使用浓度12.5 μ g/mL)、安普霉素(Apramycin，Sigma公司，使用浓度50 μ g/mL)以及其他常规试剂. 仪器包括C1000 TM PCR仪(Bio-Rad公司)、P680高效液相色谱仪(HPLC，DIOEX公司)、高效液相色谱柱为DIKMA分析C 18 色谱柱(250×4.6 mm,5 μ m)、UV1800准双光束紫外可见分光光度计(RUNQEE公司)、LTQ XL Orbitrap型高分辨率质谱仪(Thermo公司)、Varian Plus-400 MHz核磁共振谱仪(Agilent公司，CDCl 3 ,600 MHz，298 K). 培养基和培养条件 3 E.coli DH10B 和 E. coli ET12567(pUZ8002)都在LB和LA培养基中37 ℃培养.培养MA37使用液体ISP2培养基(酵母提取物4 g/L，葡萄糖4 g/L，麦芽提取物10 g/L，pH 7.2).MA37的结合转移使用改良的ISP4培养基(10 g/L可溶性淀粉，2 g/L硫酸铵，1 g/L硫酸氢二钾，1 g/L七水合硫酸镁，1 g/L氯化钠，1 g/L色氨酸，0.5 g/L酵母提取物，1 g/L蛋白胨，1 mL/L超微量溶剂，调节pH值为7.2)，该培养基还包含终浓度为30 mmol/L的Mg 2+ . 2-MIB同框缺失菌株的构建 2 2-MIB的合成基因簇 ma_mib 2包含 CDS 12、 CDS 13、 CDS 14三个基因.为了验证 ma_mib 2的功能，在3个基因中选取 CDS 14基因构建2-MIB缺失突变菌株( 图2 图2 ).首先，设计 CDS 14基因的上下游同源基因的引物(pWDY612-F,pWDY612-R).其中，pWDY612-F的5′端,pWDY612-R中的3′端15 bp与载体序列同源，而pWDY612-R 的5′端则有15 bp和待敲除的基因下游同源，pWDY612-F的3′端则有15 bp和待敲除的基因上游同源.以MA37的总DNA 为模板，KOD DNA 聚合酶扩增 CDS 14的上下游同源序列.PCR条件为:左臂(2 089 bp)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 10 s，32个循环；68 ℃ 5 min.右臂(2 059 bp)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 10 s，32个循环；68 ℃ 5 min.利用凝胶回收试剂盒回收两个目标片段.限制性核酸内切酶XbaⅠ，EcoRⅠ处理pKC1139质粒，得到pKC1139片段.将经两个酶处理过的2个片段、载体和In-Fusion酶按照1∶1∶1的体积比混合，置于50 ℃水浴15 min进行连接后，转化入 E.coli DH10B的感受态中.挑取安普霉素抗性的单菌落进行酶切分析，测序验证正确后命名为pWDY612( 图2A 图2A ).将pWDY612转化入 E.coli DH10B中，利用抗性筛选挑取单菌落,提取质粒并进行酶切分析、测序验证.将验证正确的pWDY612质粒转化入 E.coli ET12567/pUZ8002中，挑取氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素抗性的单菌落，并且通过接合转移导入MA37中，在改良的ISP4培养基上于37 ℃整合质粒，并于28 ℃多次传代培养，最终筛选得到双交换突变株 [ 17 17 ] .设计突变株验证引物(pWDY612-ID-F,pWDY612-ID-R)，PCR条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28 个循环；72 ℃ 5 min，扩增得到大小为1 096 bp的目标条带( 图2B 图2B ).最终将 CDS 14基因的同框缺失突变菌株命名为WDY612. 高效液相色谱/质谱分析 2 样品首先在流动相(A/B：从90%/10%变化至75%/25%( V/V ))中进行梯度洗脱5 min.其中，溶剂A为0.1%的甲酸/水溶液，溶剂B为0.1%的甲酸/乙腈溶液.本实验所有的高效液相色谱-质谱分析中均使用相同的色谱柱和液相梯度.随后在另一配比流动相(A/B：25%/75%( V/V ))中等度洗脱45 min.流动相流速为1 mL/min，样品紫外检测波长为247.8 nm. Neocarazostatin A的提取及纯化 2 将MA37菌种接种于15 mL液体ISP2培养基上，于28 ℃,200 r/min条件下培养2 d后，转移入300 mL液体ISP2培养基中，并于28 ℃,200 r/min条件下培养5 d.收集菌丝并将其置于原培养体积10%的丙酮中重悬，之后进行超声破碎(40 kHz,25 min).离心去除细胞团块后旋转蒸发除去溶剂，以等体积的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相并旋转蒸发除去溶剂，所得产物于原培养基体积1%的甲醇中重新溶解，以便进行HPLC或LC-MS的检测. RT-PCR检测 ma_mib 2基因敲除 2 为了验证3个基因在野生型菌株中是否表达，使用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法对其DNA表达量进行测定.首先，分别设计 CDS 12， CDS 13， CDS 14的引物.其中每一对引物分别与相应的基因有30 bp的同源臂，每对引物扩增100 bp的cDNA.用TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒对样品进行PCR测定，条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min. MA37和WDY612的RT-PCR检测方法参照TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒使用说明书. 结果与讨论 1 野生型MA37与突变菌株中 ma_mib 2基因簇的表达量 2 使用链霉菌中编码16s RNA的基因作为内参基因，用目的基因与内参基因反转录所得cDNA量的比值表示该目的基因在菌株中的表达量相对值.如 图3 图3 所示，2-MIB的生物合成基因簇 ma_mib 2中3个基因均能在野生型菌株(WT)中表达，暗示MA37在本实验室条件下能够合成2-MIB；而在突变菌株WDY612中 CDS 14基因的表达量大幅减少，说明化合物2-MIB不能正常表达. 发酵产物产量的HPLC分析 2 对MA37野生型菌株和突变菌株WDY612进行了8 L的大量发酵，经过7 d的培养，菌体经提取和纯化，最终分离到了10 mg发酵产物.对比WT和WDY612发酵产物的HPLC谱图( 图4 图4 )，发现WDY612的发酵产物中，对应31.5 min处的化合物产量有明显提高，且该化合物保留时间与Neocarazostatin A的出峰时间一致，说明 ma_mib 2基因簇中 CDS 14基因的敲除可能导致了Neocarazostatin A产量的提高. 发酵产物的结构表征 2 为进一步验证上述发酵产物与Neocarazostatin A的关系，对该化合物进行了质谱分析( 图5A 图5A )，发现其分子相对分子质量为370.2，化学组成为C 22 H 28 NO 4 + (相对分子质量偏差为3.5×10 -6 )，而这一分子离子峰的二级碎片里面含有与Neocarazostatin A相同的两个碎片( m/z =151.1和169.1).该化合物的紫外可见吸收光谱( 图5B 图5B )显示其3个特征吸收峰波长分别为247.8，291.7，344.3 nm，与Neocarazostatin A一致.同时，发酵产物的 13 C NMR数据( 表3 表3 )与已报道的Neocarazostatin A的数据 [ 2 2 ] 比较也显示，相关原子的化学位移相一致.因此，可以确定该发酵产物为Neocarazostatin A. 2 C原子 2 δ C 文献值 [ 2 2 ] 实测值 1 114.8 112.4 2 127.7 126.4 3 139.5 138.1 4 145.0 144.0 4a 112.6 110.7 4b 124.0 122.5 5 122.7 121.9 6 132.8 133.1 7 126.1 125.9 8 110.9 110.2 9 - - 9a 138.0 136.9 10 76.5 76.3 11 71.4 70.6 12 19.9 19.1 13 13.2 13.1 14 61.4 61.6 15 35.5 34.6 16 126.1 124.7 17 132.1 131.7 18 18.0 26.0 19 26.0 18.1 上述结果最终证实，通过敲除2-MIB的合成基因簇中的 CDS 14基因，确实可以提高Neocarazostatin A的产量. Neocarazostatin A高产机制分析 2 萜类化合物的生物合成前驱体为IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP).前期的同位素标记实验证实 [ 9 9 ] ，三环咔唑碱的异戊烯结构单元来源于非甲羟戊酸途径.同时，本研究结果表明， ma_mib 2基因簇中 CDS 14基因敲除后，2-MIB产量也大幅下降，而突变株中Neocarazostatin A的产量大幅提升,二者代谢途径之间确实存在Crosstalk.由此可以推测( 图6 图6 )，异戊二烯基供体IPP是以上两个途径共同的前驱体，敲除2-MIB的生物合成相关基因造成IPP更多地流向Neocarazostatin A的代谢途径，故能提高其产量. 结论 1 基于代谢途径间的Crosstalk现象，本研究敲除萜类化合物2-MIB合成基因簇 ma_mib 2中的 CDS 14基因后，其合成途径被阻断，IPP流向Neocarazostatin A的合成途径，最终提高了Neocarazostatin A的产量.基于此，我们推测在其他真核或原核细胞中代谢途径中也可能存在Crosstalk现象，一些在细胞中含量低、有药用价值的化合物，可以通过在宿主细胞寻找与其生物合成有Crosstalk关系且产量较大的化合物，对其合成基因簇进行敲除而阻断其合成途径，从而使代谢底物或中间体流向目标化合物的合成途径，提高产量. 参考文献 SCHMIDT A W, REDDY K R, KNöLKER H J. Occurrence, biogenesis, and synthesis of biologically active carbazole alkaloids [J]. Chemical Reviews, 2012, 112(6): 3193-3328. DOI: 10.1021/cr200447s. KATO S, SHINDO K, KATAOKA Y, et al. Studies on free radical scavenging substances from microorganisms.Ⅱ. Neocarazostatins A, B and C, novel free radical scavengers [J]. 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