用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造

用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造 Genetic Engineering of an Industrial Mycobacterium neoaurum Strain for Selectively Producing Androstenedione first-author 余舒琪,女,硕士生, 现从事生物制造研究. E- mail: 2013203060019@whu.edu.cn 余舒琪,女,硕士生, 现从事生物制造研究. E- mail: 2013203060019@whu.edu.cn 2013203060019@whu.edu.cn corresp E- mail:quxd@whu.edu.cn E- mail:quxd@whu.edu.cn quxd@whu.edu.cn 武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072 School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 工业上用于生产4- 雄烯- 4- 醇- 3,17- 二酮(4- 雄烯二酮，4- AD)的小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)在降解植物甾醇侧链的过程中同时产生部分1,4- 雄烯- 4- 醇- 3,17- 二酮(1,4- 雄烯二酮，ADD)，而3- 甾酮- Δ 1 - 脱氢酶KstD催化了4- AD到ADD的转化.克隆该工业菌株的 kstD 基因测序后发现，其与报道的标准分枝杆菌基因组中的 kstD 基因相比有3个氨基酸的突变(A6E，S138L，A193V).这些突变使得KstD的酶活受到影响，一定程度上阻碍4- AD向ADD的转变.为了实现从植物甾醇降解中选择性地得到4- AD或ADD，通过敲除 kstD 基因，阻断4- AD到ADD的转化，获得一株只产4- AD的突变菌株，代谢产物中4- AD达79.3%.通过修复kstD酶的氨基酸位点，使之恢复到文献报道的正常序列，并在敲除 kstD 基因菌株中，将修复后的 kstD 基因安置在强启动子pG13下，重新导回到突变菌株中进行回补强化表达，获得一株可以大量产生ADD的菌株.野生型分枝杆菌转化植物甾醇产生的产物中，ADD仅占27.0%，经回补强化表达后的基因工程菌株转化植物甾醇产生的产物中ADD占63.0%.结果表明，通过敲除或者在突变体菌株中过表达正常的 kstD 基因可以使该工业菌株选择性地优产4- AD或ADD. The industrial strain Mycobacterium neoaurum ( M.neoaurum,MN ) produces androst- 4- ene- 3,17- dione (4- AD) and androsta- 1,4- diene- 3,17- dione (ADD) together during degradation of phytosterols, which causes a challenge for downstream products isolation and purification. By cloning and sequencing MN- WT’s 3- ketosteroid- Δ 1 - dehydrogenase ( kstD ) gene, we found that kstD gene has three point mutations(A6E, S138L, A193V) comparing with the reported gene from standard strain. We assumed that this mutations might impair the enzyme activity, decrease the conversion rate of 4- AD to ADD. In order to achieve a strain that can selectively produce 4- AD or ADD from phytosterols, we first deleted the kstD gene,obtained a mutant strain of 4- AD( MN - Δ kstD ), in which 4- AD accounts for 79.3% of total metabolites; and second, we repaired kstD gene and placed it under a strong prompter pG13 to overexpress this enzyme in the MN - Δ kstD strain. In MN - WT strain, the concent of ADD in the phytosterols biotransformation products is 27.0%. then the concent brings up to 63.0% in the MN - Δ kstD- kstD * strain. Our work generated two strains that can either produce 4- AD or majorly produce ADD via phytosterols degradation, which will be convenient for the downstream products separation process. 甾醇降解 1,4- 雄烯二酮 4- 雄烯二酮 3- 甾酮- Δ 1 - 脱氢酶 基因修复 steroid degradation androst- 1,4- diene- 3,17- dione androst- 4- ene- 3,17- dione 3- ketosteroid- Δ 1 - dehydrogenase gene repair 引言 1 甾体药物在临床上占有重要地位，全球市场对甾体药物平均年销售额在400亿美元以上，约占世界医药产品总额的10% [ 1 1 ] .甾体药物的生产方式分为化学合成和微生物转化法，其中微生物法环境污染小，生产成本低，通过转化可获得雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮,4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(1,4-雄烯二酮,ADD)等甾体药物的重要中间体 [ 2 2 ~ 4 4 2~4 ] .目前，已发现有许多微生物能降解植物甾醇，如诺卡式菌和分枝杆菌 [ 5 5 , 6 6 ] 等.微生物通过体内的甾醇转化酶系可以高效降解植物甾醇侧链，20世纪70年代初，应用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功 [ 7 7 , 8 8 ] . 目前，我国仍主要以依赖于从植物中提取甾体前体 [ 9 9 ] ，并利用化学方法降解生产ADD [ 10 10 ] .由于该方法能耗和人工成本均较高，环境污染较大，因此亟需在微生物降解领域，特别是菌种选育方面取得突破.近年来，一些甾醇降解菌株基因组测序的完成，以及甾醇降解机制的深入研究，为运用基因工程手段构建高产稳定的甾醇转化工程菌株提供了重要的基础 [ 11 11 ~ 13 13 11~13 ] .分枝杆菌降解植物甾醇过程中，植物甾醇首先在一系列酶的转化下生成4-AD，而后在3-ketosteroid-Δ 1 -dehydrogenase(KstD)酶催化下将4-AD转化成ADD [ 14 14 ~ 16 16 14~16 ] (见 图1 图1 ).KstD酶作为膜结合蛋白在微生物体内的表达量有限，因此在甾醇转化的过程中往往只有部分的4-AD被转化成ADD [ 17 17 ] .而由于4-AD和ADD化学性质相近，两者的分离纯化非常困难.有研究报道，通过基因工程方法可以阻断或过表达 kstD 基因，实现优产4-AD或ADD [ 17 17 ~ 19 19 17~19 ] . 本研究对一株工业用生产4-AD和ADD的小金色分枝杆菌( Mycobacterium neoaurum )的 kstD 基因进行改造，使甾醇的转化产物主要为4-AD或ADD，可望为工业优产4-AD和ADD提供理论依据. 实验部分 1 材料与仪器 2 小金色分枝杆菌( MN -WT，仙琚药业公司);在 MN -WT基础上敲除了 kstD 基因的突变菌株 MN -Δ kstD (本实验构建);在 MN -Δ kstD 基础上过表达修复后的 kstD * 基因的突变菌株 MN- Δ kstD-kstD * (本实验构建). pK18mobsacB基因敲除质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)：利用该质粒上的致死自杀基因 sacB 在蔗糖培养基上进行反筛选，可快速获得基因无痕敲除菌株 [ 20 20 ] ;PMV307是带有强启动子pG13的整合型质粒，由PMV306 [ 11 11 , 18 18 ] (华东理工大学魏东芝老师提供)改造：强启动子pG13(序列见 表1 表1 )首先由基因合成获得，而后被克隆至PMV306的 Eco RV- Eco RI位点;pMD18-T质粒(Takara公司); E.coli DH5a菌种(本实验室保存). Function Primers Sequence (restriction sites are unlined) Note kstD knockout kstD-L-F kstD-L-R kstD-R-F kstD-R-R A TCTAGA CTCCTTGATCGAGGCGGTGATC A CTCGAG CGTCACGCTGCAGAACCTCGTTG A CTCGAG GTGCGTTGCGCGACGACAACTC A AAGCTT GTGTCCGGCATCGACGCATCTG Xba Ⅰ Xho Ⅰ Xho Ⅰ Hind Ⅲ kstD kstD-F AGAATTCCCTCGTAATCTCATCAGGCCCT EcoR Ⅰ clone kstD-R ATGTCGACTCAGGCCTTTCCAGCGAGAT Sal Ⅰ kstD repair E6A-F E6A-R L138S-F L138S-R V193A-F V193A-R GTGTTCTACATGACT GCC CAGGACTACAGTGTCT AGACACTGTAGTCCTG GGC AGTCATGTAGAACAC TAAGGCCACCGGCCGC TCG GTCGAGCCCAAGCCGT ACGGCTTGGGCTCGAC CGA GCGGCCGGTGGCCTTA GCTGCGCAGCATCAA GGC GGGTGTGCGGTCGGTGT ACACCGACCGCACACCC GCC TTGATGCTGCGCAGC Mutated codons are indicated by italics Strong promoter pG13 A GATATC GATCGCCACTAGCGCCGCGGTCGGAATC AGCGCACTGGCCGCCGGAGCGGTCAGCTACCTGTT GCTGCGCCGCTTCGCTTTCTAGCACCGACGTCCCGG CGCCAGCAGCTACCTCTCGAGCAAACGTTTTGCGCG CCCGAAAAATAAGTCGTTGCAGAACTTTCATGAATTAG GCCTTGCTGCGCCCAGGCTCCAGTAGTAGAAATGGAG TCACGGCAGCCCGGTGAAGCCAAGGTCGAACCGGAA GAGAAGGTTCGTCCTCCCGACCCGGGCACCCAGCAC GGCCCCCGGAACCCACGCGGAGTCATAGCCGCGATA ATGGCAGAAGTGTTGCGGGCCTGCGTAATTGCGAAATT CAGATGGTGCCGGCGGCCCTTTGGGTGGGGCTGCAGC CAGAAGGGTCGCAAAAGCGCCGAGGCCAACCCACGC AGCCCACAAATGCACGCTTGGTAACCGA GAATTC CGG Eco RV Eco RI 高保真酶PrimerSTAR、限制性内切酶、T4连接酶(Takara公司);PCR Taq酶(鼎国生物公司);质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)公司). 实验涉及引物见 表1 表1 . Lemco培养基：peptone 5 g/L，lemco 5 g/L，NaCl 5 g/L.发酵种子培养基：葡萄糖6 g/L，NaN O 3 5.4 g/L，甘油2 g/L,酵母提取物15 g/L，(NH 4 ) 2 HP O 4 0.6 g/L，吐温-80 10 g/L，pH 8.0.发酵培养基：大豆饼粉15 g/L，柠檬酸2.2 g/L，尿素0.5 g/L，(NH 4 ) 2 HP O 4 1.5 g/L，MgSO 4 0.5 g/L，FeS O 4 0.1 g/L，CaCO 3 3 g/L，吐温-80 10 g/L，HP-β-CD 40 g/L，植物甾醇30 g/L，pH 7.0~7.2，灭菌后补加灭菌过的葡萄糖20 g/L. 仪器：5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司);bio-RAD电泳仪(Bio-Rad公司);GBOXBOX-EF型凝胶成像仪(Syngene公司);SIL-20A型岛津HPLC (检测器UV240nm，Shimadzu公司);LTQ Orbitrap XL高分辨液相色谱质谱联用仪(HRESI-MS，Thermo Fisher Scientific公司). 实验方法 2 感受态的制备 3 将菌种活化后扩大培养，按1%接种量接于含有50 mL培养基的500 mL摇瓶中，30 ℃，200 r/min至光密度O D 600 nm =1.2左右，将菌液于冰水中静置1 h，4 500 r/min，4 ℃，离心10 min，收集菌体，用预冷的10%甘油洗涤，再次离心10 min，收集菌体，重复3次.最后加入500~1 000 μL的10%甘油重悬，按每管100 μL分装至预冷的无菌EP管中. 重组质粒的构建 3 利用 表1 表1 中的引物 kstD -L-F和 kstD -L-R以 MN -WT野生菌株的DNA为模板扩增出基因置换的上游同源臂(1.7 kb)，以引物 kstD -R-F和 kstD -R-R扩增出下游同源臂(1.6 kb).用高保真酶PrimerSTAR 进行PCR(聚合酶链式反应)，结束后加入1 μL Taq酶，72 ℃反应30 min，在平末端的DNA两端加上A尾，经胶回收后克隆至pMD18-T中，测序验证.以限制性内切酶 Xba Ⅰ和 Xho Ⅰ切割带有上游同源臂的质粒，以 Xho Ⅰ和 Hind Ⅲ切割带有下游同源臂的质粒，回收相应的同源臂片段，克隆至 Xba I- Hind Ⅲ双酶切的pK8mobsacB质粒中，得到用于基因敲除的质粒. 依次利用 表1 表1 中的引物E6A-F、E6A-R，L138S-F、L138S-R和V193A-F、V193A-R，进行PCR，得到点突变的序列(A转为E，S转为L，A转为V).其中，Glu为谷氨酸(简称E)，Ala为丙氨酸(简称A),Leu为亮氨酸(简称L),Ser为丝氨酸(简称S),Val为缬氨酸(简称V).通过点突变，得到修复的 kstD * 基因.随后以 Eco RⅠ和 Sal Ⅰ酶切pMV307质粒，将 kstD * 基因克隆至该质粒中，得到用于强化表达 kstD * 基因的质粒. 基因敲除 3 将所构建的重组质粒在大肠杆菌进行扩大培养，按手提法进行质粒提取 [ 21 21 ] . 将制备的重组质粒加入感受态中，混匀后静置15 min，转移至经过预冷的2 mm电转杯中，2.5 kV，23 ms的条件下进行电转化，然后于冰上静置10 min，加入1 mL的Lemco重悬细胞，30 ℃，200 r/min培养2~3 h，涂布于含有30 μg/mL卡那霉素的Lemco培养板上，30 ℃培养3~5 d.能够在含有卡那霉素平板上长出的单菌落说明发生了第一次同源重组.挑取单菌落于液体的Lemco培养基中进行传代松弛，连续进行两次转接传代，用无菌的二次蒸馏水将传代培养的菌液进行梯度稀释，然后按以下方式涂布于相应的平板，10 -2 于A(Lemco+Kan+Suc)，C(Lemco+Suc);10 -4 于B(Lemco+Kan)，D(Lemco+Suc)(Suc为10%蔗糖).如果出现A平板上的克隆远小于B平板，说明蔗糖致死基因 sacB 在分枝杆菌的基因组中整合并起到了相应的致死效应.挑取CD平板上的单克隆，分别在Lemco和Lemco+Kan平板上进行接种，剔除少量蔗糖致死效应失效的克隆菌株.挑取10~20株能够在Lemco平板上生长而不能在Lemco+Kan平板上生长的菌株，转接至液体培养基中扩大培养.将这些菌株的DNA以及野生型的菌株的DNA分别用验证引物进行PCR，分析基因大小确证基因是否发生缺失. 发酵产物的检测 3 待发酵转化结束，取发酵液离心去除菌体，用等体积的乙酸乙酯对发酵液进行两次20 min的超声萃取，收集萃取液，低温减压旋蒸，用等体积的乙腈进行复溶，0.22 μm滤膜过滤.通过C18反相柱对发酵产物进行HPLC分析 [ 22 22 ] ,条件如下：流速1 mL/min，流动相A(水)，B(乙腈);0~20 min，50%~90% B;20~25 min，90% B;进样量10 μL. 结果与讨论 1 kstD 基因缺失菌株的转化产物分析 2 在植物甾醇的降解途径中(见 图1 图1 ) [ 14 14 ~ 16 16 14~16 ] ，催化4-AD到ADD转化的酶为KstD;通过分析 M. neoaurum ATCC 25795的基因组 [ 23 23 ] ，找到其中存在3种KstD同工酶(KstD1~3) [ 13 13 ] ，分别以9-OH AD、睾酮、4-AD为最适底物，KstD1和KstD 3参与构成甾醇代谢的两条主要代谢流通路.本研究中的工业菌株 MN -WT降解植物甾醇的产物中含65.0% 4-AD和27.0% ADD，推测其基因组存在一条与 kstD3 同源的基因.为彻底消除产物中的ADD，对分枝杆菌中的 kstD 基因进行敲除.按实验方法制备重组质粒，并转化至 MN -WT的感受态中，通过在蔗糖培养基上的筛选获得了 kstD 缺失的突变株.突变菌株的基因型经PCR验证，结果如 图2 图2 所示. 1：10 000 DNA Marker;2:回复突变株;3/4: kstD 基因缺失突变株 1：10 000 DNA Marker;2:PCR products of restoration type; 3/4:PCR products of kstD deletion type 对野生型及 kstD 缺失的突变菌株的转化产物进行HPLC分析(见 图3 图3 )，采用液相峰面积比(归一化法)计算各物质含量(见 表2 表2 ).野生型菌株发酵产物中，4-AD占总发酵产物的65.0%，还含有部分的ADD;而 kstD 基因缺失菌中4-AD上升到79.3%，ADD不再产生， kstD 基因的缺失使得4-AD转化为ADD的途径完全被阻断. 1: MN -WT;2: MN-kstD ;3: MN -Δ kstD-kstD * 强化表达 kstD * 菌株的发酵产物分析 2 利用 表1 表1 中的引物 kstD -F和 kstD -R克隆了 MN -WT菌株中的 kstD 基因，发现其相对于ATCC 25795中的 kstD 基因存在3个点突变：Glu-6→Ala，Leu-138→Ser，Val-193→Ala.我们推测，这些突变位点是该工业菌株在诱变育种过程中引入的，它们减弱了KstD3酶的活性，阻碍了4-AD向ADD的转变.为使该菌株能够优产ADD，首先按实验方法得到用于强化表达 kstD * 基因的质粒，电转入敲除了 kstD 的 MN -Δ kstD 菌株中，获得 MN -Δ kstD-kstD * 菌株. 对 MN -Δ kstD-kstD * 菌株降解甾醇的发酵产物进行HPLC分析，结果如 图3 图3 、 表2 表2 所示.采用液相峰面积比(归一化法)，原始菌株中4-AD占所有代谢产物的65.0%，ADD占所有代谢产物的27.0%;强化表达 kstD 后，4-AD占所有代谢产物的22.0%，ADD占所有代谢产物的63.0%.经过修复后强化表达的 kstD * ，可以催化产生大量ADD，证实了该策略的有效性. 4 % Strain 4-AD ADD residual MN -WT 65.0 27.0 8.0 MN -Δ kstD 79.3 0 20.7 MN -Δ kstD-kstD * 22.0 63.0 15.0 结论 1 本研究利用基因工程手段，对用于生产4-AD和ADD的工业用小金色分枝杆菌的 kstD 基因进行敲除、过表达修复后 kstD * 基因，获得两株突变菌株可以选择性地优产4-AD或ADD.与野生型菌株相比，在前50 h，敲除了 kstD 基因的菌株在甾醇培养基上的生长无明显影响，此后迅速增长至OD 600 nm =1.2，与原始菌几乎接近.后续研究可以继续选择其他来源的 kstD 基因，以及进一步强化表达 kstD 基因来提高ADD的转化率.此外，由于使用 kstD 基因缺失菌株作为 kstD 基因的强化表达母体，故在发酵产物中还残留一些副产物，可以通过选择性敲除生成这些杂质的菌株为母体，实现副产物最大限度的清除，进一步提升生产力. 参考文献 张乐乐, 张显, 邵明龙, 等. 表达3-甾酮-Δ~1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮[J]. 生物工程学报, 2015, 11: 1589-1600.DOI: 10.13345/j.cjb.140579. 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