微生物降解植物甾醇制备4-雄烯-4-醇-3,17-二酮的无油工艺

微生物降解植物甾醇制备4-雄烯-4-醇-3,17-二酮的无油工艺 Oil-Free Process for Preparing Androst-4-Ene-3,17-Dione via Microbial Degradation of Phytosterols first-author 张亚楠, 女, 硕士生, 现从事生物催化研究. E-mail:zyn0203@163.com 张亚楠, 女, 硕士生, 现从事生物催化研究. E-mail: zyn0203@163.com zyn0203@163.com corresp E-mail:quxd@whu.edu.cn E-mail:quxd@whu.edu.cn quxd@whu.edu.cn 武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072 School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 研究了一种利用工业用菌株野生小金色分枝杆菌（ Mycobacterium neoaurum ）催化降解甾醇制备4-雄烯-4-醇-3,17-二酮（4-雄烯二酮，4-AD）的无油工艺.从静态细胞转化法和发酵法中选择发酵法，研究了甾醇投料量、助溶剂、分散剂、金属离子、发酵时间等条件对菌株生长状态、发酵底物转化率和4-AD产量的影响，对助溶剂、分散剂、底物的用量和接种量4个较重要的因素进行3个水平的正交实验.最佳工艺为：采用发酵法，甾醇投料量30 g/L、助溶剂羟丙基 β -环糊精40 g/L、分散剂吐温-80 5 g/L、接种量20%、亚铁离子0.4 g/L、发酵时间120 h；4-AD的产量最高达到14.3 g/L，转化率达到76%. Oil-free process for preparing androst-4-ene-3,17-dione (4-AD) from degradation of phytosterols catalyzed by an industrial strain Mycobacterium neoaurum has been studied. Fermentation-based transformation was better than Static cell transformation. Meanwhile, influence of inventory rate of phytosterols, co-solvents, dispersants, metalions and fermentation time on the yield of 4-AD were further systematically studied. Four important factors including co-solvents, dispersants, inventory rate of phytosterols and inoculation size had been made orthogonal experiments on three levels. The results showed that 30 g/L inventory rate of phytosterols, 40 g/L hydroxypropyl- β -cyclodextrin, 5 g/L Tween-80, 20% inoculum size, 0.4 g/L ferrous ions and 120 h fermentation time were the optimum processing conditions. The yield of 4-AD from phytosterols was up to 14.3 g/L, and the conversion was up to 76%. 微生物降解 植物甾醇 4-雄烯二酮 无油工艺 degradation phytosterols androst-4-ene-3,17-dione oil-free process 引言 1 甾体药物在临床上占有重要的地位，根据其功能不同，甾体药物大致可以分为性激素、皮质激素和蛋白同化激素 [ 1 1 ] .近年，甾体类药物在全球市场的年平均销售额超过了400亿美元，约占世界医药产品总额的10% [ 2 2 , 3 3 ] .4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮，4-AD)是甾类原料药的核心中间体，几乎所有甾体激素药物都可以以4-AD为起始原料进行生产 [ 4 4 ] .当前，4-AD的全球年销售额约为100亿美元，平均市场增长率约10% [ 5 5 ] .因此，4-AD大规模生产的市场前景非常诱人 [ 5 5 ] . 甾体类药物最初主要是从动物肾上腺、性腺和尿液中提取 [ 6 6 ] ，随后发展到人工化学合成甾体激素阶段 [ 7 7 ] ，但化学合成步骤多,得率低,导致成本很高.文献 [ 8 8 ] 报道了很多微生物，如：诺卡氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、棒状杆菌、节杆菌等均能催化降解甾醇.采用微生物转化法降解植物甾醇侧链以生产甾体类药物中重要的中间体4-雄烯-4-烯-3,17-二酮(AD)的方法环境污染小、生产成本低、过程简单，且代谢途径人工修饰可能性强，具有很大优势 [ 9 9 , 10 10 ] .除了菌株的催化能力外 [ 11 11 ] ，生产工艺也对甾醇转化非常重要.由于甾体具有很强的疏水性，在水中的溶解度非常小，而负责甾体降解的酶属于胞内酶，底物需要进入细胞后才能进行转化反应 [ 12 12 ] .传统的分枝杆菌转化工艺通过植物油或者表面活性剂 [ 13 13 ] 等来促进甾醇的溶解，从而实现较高浓度的投料.然而，采用植物油提高底物的溶解度的方法有很多缺点，一方面提高了生产的成本和危险系数，另一方面大大增加了下游工艺繁琐程度与难度，且一般工艺的底物投料量较少，总产量相对较低.如：杨英等 [ 14 14 ] 利用分枝杆菌降解植物甾醇制4-AD的工艺中，开发的葵花油/水系统投料浓度仅0.4%;柏挺 [ 15 15 ] 利用优化的大豆油/水系统的底物投料量略有提高，但也仅1.5%.因此开发产量高的水相催化工艺十分必要.徐阳光等 [ 16 16 ] 开发了以环糊精为增溶剂的非油相系统，在简化工艺的基础上投料浓度也达到了1.5%. 因此，基于工业上对更高投料浓度、更高转化率以及更环保绿色的工艺需求，本文设计了一系列实验来研究生物降解植物甾醇制备4-AD的无油工艺.本研究首先对静态细胞转化法和发酵法两种生物转化方法进行了选择，然后考察了小金色分枝杆菌( Mycobacterium neoaurum )转化4-AD的最佳发酵时间，研究了助溶剂、分散剂、甾醇投料浓度、金属离子等因素对菌株生长状态和底物转化率的影响. 实验部分 1 菌种与培养基 2 野生小金色分枝杆菌( Mycobacterium neoaurum ，简称MN-WT)购自浙江仙琚制药公司. 平板培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，酵母膏3，葡萄糖3;pH 8.0. 发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖6，NaN O 3 5.4，甘油2，酵母提取物15，(N H 4 ) 2 HP O 4 0.6，吐温-80 10;pH 8.0. 基础发酵培养基(g/L)：大豆饼粉15，柠檬酸2.2，尿素0.5，(N H 4 ) 2 HP O 4 1.5，MgS O 4 0.5，FeS O 4 0.1，CaC O 3 3，吐温-80 10，羟丙基 β -环糊精40，葡萄糖20，植物甾醇投料量30;pH 7.0~7.2. 仪器与试剂 2 仪器：LC-20AT型岛津高效液相色谱(HPLC，Shimadzu公司)，Promosil C18分析柱(博纳艾杰尔公司，4.6 mm×250 mm)，ZWY-2102C型摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)，SPX-70BIII生化培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司). 试剂：羟丙基- β -环糊精、甲基- β -环糊精、吐温-80、Triton X-100、Triton X-114以及硫酸亚铁氨等试剂均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司. 实验方法 2 微生物转化方法 3 将冷冻保藏的菌种于平板培养基上划线培养，置于生化培养箱中30 ℃培养5 d ，挑取单克隆接至5 mL培养基中，30 ℃，200 r/min，培养3 d，然后按10%的接种量转接至大量发酵种子培养基中，以相同的条件进行活化扩大培养，得到发酵种子液分别按以下两种方法进行微生物转化. 1) 发酵法：将上述种子液按15%的接种量转接至250 mL发酵摇瓶中(含有50 mL基础发酵培养基)，底物投料量为2%，30 ℃，200 r/min培养6 d，使菌体对底物进行充分发酵转化. 2) 静态细胞转化法 [ 17 17 ] ：将上述种子液按15%的接种量转接至250 mL发酵摇瓶中(含有50 mL基础发酵培养基)，30 ℃，200 r/min下培养6 d，离心，收集菌体用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7.5)洗涤3次，重悬.底物投料量为2%，30 ℃，200 r/min下发酵3 d，使菌体对底物进行充分转化. 甾醇降解产物检测方法 3 取发酵液离心去除菌体，用等体积的乙酸乙酯(EA)进行两次20 min超声萃取.收集萃取液，低温减压旋转蒸干，用等体积的乙腈复溶稀释后，0.22 μm滤膜过滤除去不溶物.HPLC检测分析用流动相A相为水，B相为乙腈，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长240 nm;二元洗脱梯度为：(以B相为标准)50%~90% 20 min，50% 5 min.植物甾醇摩尔转化率 [ 15 15 ] 计算如下： http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4259752&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4259752&type=small http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4259752&type=middle 其中：0.95为甾醇纯度;0.66为4-AD与甾醇摩尔质量比. 结果与讨论 1 微生物转化方法对比 2 将静态细胞转化法和发酵法得到的发酵液处理后进行HPLC检测，如 图1 图1 所示，对应数据如 表1 表1 所示.可知，静态细胞转化法的转化产物总量较多，但转化产物较为杂乱，有大量甾醇降解副产物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)及22-羟基-23,24去甲胆甾-4-烯-3-酮(4-BNA)的累积，且甾醇转化为4-AD的转化率(19.1%)比发酵法的转化率(22.3%)低.同时，由于制备静态细胞的方法复杂且耗时长，故该工艺并无优势.因此，后续研究采用传统发酵方法. 1：ADD;2：4-AD;3：4-BNA;4：静态细胞转化法降解甾醇产物;5：发酵法降解甾醇产物 1:ADD;2:4-AD;3:4-BNA;4:degradation product of phytosterols catalyzed by static cell transformation;5:degradation product of phytosterols catalyzed by fermentation-based transformation 2 方法 3 4-AD 2 ADD 2 4-BNA 比率/% ρ /g· L -1 转化率/% 比率/% ρ /g· L -1 比率/% ρ /g· L -1 静态细胞转化法 20 2.4 19.1 35 3.6 35 4.8 发酵法 70 2.8 22.3 12 0.5 15 0.7 发酵时间的优化 2 采用传统发酵法考察了甾醇的转化率随时间的变化情况.如 图2 图2 所示，发酵120 h 时甾醇的转化率和4-AD产量达到最高，随着时间的延长，甾醇的转化率反而略有下降.这是因为随着时间的延长培养基的成分或细胞的生长状态发生改变，使胞内某些酶的酶活发生变化，促使甾醇环链降解导致产物的浓度下降. 4-AD产量的影响因素 2 助溶剂 3 甾醇在水中的溶解度较低 [ 18 18 ] ，且降解甾醇需要利用活菌转化，因此应选择无毒害的助溶剂和分散剂.环糊精作为甾醇转化的助溶剂 [ 18 18 ] ，一方面对甾醇有一定促溶作用，另一方面对甾醇的悬浮有利，并且在保护细胞免受甾醇的毒性作用方面有着较为显著的作用.不同种类的环糊精对发酵转化率的影响有着明显的区别.羟丙基- β -环糊精(HP- β -CD)和甲基- β -环糊精(M- β -CD)在水中溶解度高，600~800 g/L，不溶于有机溶剂，有利于后期产物的萃取.另外，HP- β -CD和M- β -CD作为助溶剂的投入量与甾醇投料量可以达到摩尔比为1∶1 [ 16 16 ] .本研究对比了这两种环糊精对甾醇转化的影响，如 图3 图3 所示，HP- β -CD比M- β -CD作为助溶剂的效果更好，甾醇的转化率达到27%，4-AD的产量达到3.38 g/L.在甾醇料量为20 g/L时，利用HP- β -CD作为助溶剂(与甾醇的摩尔比1∶1)，以野生菌株MN-WT催化甾醇(发酵法)的分析甾醇的转化率为66.2%，与植物油发酵工艺相当 [ 16 16 ] ，但投料量为20 g/L，比植物油发酵的投料量大很多. 分散剂 3 目前主流的分散剂有聚醚硅油、PEG2000、吐温-80、Triton X-100和Triton X-114等 [ 15 15 ] .其中，吐温-80，及Triton X-100与Triton X-114的混合溶剂效果较好 [ 18 18 ] .当吐温-80添加量为1%时，底物投料量为3%;Triton X-100与Triton X-114混合分散剂(摩尔比1∶1)添加量为4%时，底物投料量为3% [ 13 13 ] .尽管有研究发现，甾醇在Triton试剂分散下形成的浊点系统在一定程度上能加大底物的投料量，但总体上对底物的投料量和转化率的影响并不大，且该混合溶剂的促溶效果较吐温-80差 [ 16 16 ] .因此，本研究选择以吐温-80作为分散剂，结合助溶剂加大对底物的溶解度. 甾醇投料量 3 尽管分散剂和助溶剂的能力很高，但菌株对高浓度甾醇的毒害作用依然无法耐受 [ 19 19 ] ，因此本研究对菌株对不同甾醇投料量的耐受性能重新进行筛选.实验发现，将甾醇的投料量增加到3%时，野生小金色分枝杆菌的生长受到轻微抑制，投料量增加至4%时，菌体生长受到严重抑制，而单独的HP- β -CD和吐温-80没有表现出对菌株的抑制作用.因此可以确认，菌株的生长受到抑制是由高浓度的甾醇引起.甾醇投料量在本研究中同样是4-AD产量的影响因素. 金属离子 3 由于甾醇的侧链氧化是由氧化酶催化的，而氧化酶中富含有金属离子如锰离子，亚铁离子和镁离子 [ 19 19 ] ，因此本文较为详细地研究了金属离子对底物转化率的影响.分别将浓度为0.2 g/L和0.4 g/L的锰离子，亚铁离子和镁离子添加到发酵液中进行发酵，并以不添加任何金属离子作为对照.由 图4 图4 可知，金属离子的种类及其添加量的不同对甾醇的转化率和4-AD产量的影响也不同，其中0.4 g/L亚铁离子(硫酸亚铁铵)对底物转化有较为显著的促进作用. 正交实验优化发酵方法 2 为进一步优化该工艺的发酵条件，在已经确定的发酵方法、发酵时间，以及添加0.4 g/L亚铁离子的基础上，以发酵液中的4-AD含量作为指标，对底物的投料量(A)、助溶剂加入量(B)、分散剂加入量(C)、接种量(D)这4个较为重要的因素进行3水平4因子(如 表2 表2 )的正交实验，结果如 表3 表3 所示.由正交实验得出的最佳发酵条件组合为：投料量30 g/L,羟丙基- β -环糊精40 g/L，吐温-80 5 g/L，接种量20%.此时的4-AD产量为14.3 g/L，转化率为76%. 因素 A B C D 水平1 20 20 5 10 水平2 30 30 10 20 水平3 40 40 15 30 实验号 A B C D Yield/g\5L -1 1 1 1 1 1 9.8 2 1 2 2 2 8.4 3 1 3 3 3 10.3 4 2 1 2 3 13.4 5 2 2 3 1 9.6 6 2 3 1 2 14.3 7 3 1 3 2 13.5 8 3 2 1 3 10.6 9 3 3 2 1 12.7 k 1 9.5 12.1 12.2 10.7 k 2 12.4 9.5 11.5 12.1 k 3 12.3 12.4 11.1 11.4 结论 1 本研究对静态细胞转化法和发酵法进行对比后，选择发酵法，并对发酵时间进行条件优化，对助溶剂、分散剂、甾醇投料量、金属离子等影响因素进行考察以提高甾醇的转化率.通过4因素3水平正交实验确定最佳工艺为：采用发酵法，甾醇投料量30 g/L、助溶剂羟丙基 β -环糊精40 g/L、分散剂吐温-80 5 g/L、接种量20%、亚铁离子0.4 g/L、发酵时间120 h;4-AD的产量最高达到14.3 g/L，转化率达到76%. 本研究中植物甾醇的投料量达到3%，而已报道的传统植物油工艺的植物甾醇投料量为0.4%~1.5% [ 15 15 , 16 16 ] ，非油相体系也只有1.5%;同时，本工艺中底物的转化率达到76%，较已报道的非油相系统 [ 16 16 ] 中底物的转化率(60%)高.本文报道的水相催化转化植物甾醇无油工艺，可望降低下游工艺的繁琐与难度，改变一般工艺的底物投料量较少、总产量相对较低的现状. 参考文献 王普, 陈希杨, 虞炳钧, 等. 新技术在甾体药物微生物转化中的应用[J]. 化工进展 , 2002, 11:805-808, 813. 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