半胱胺修饰的FePt纳米颗粒对HeLa细胞的毒性

半胱胺修饰的FePt纳米颗粒对HeLa细胞的毒性 Cytotoxicity of Cysteamine Modified FePt Nanoparticles in HeLa Cells 1 first-author 张雷, 男, 硕士生, 现从事纳米医学方面的研究. E-mail: zlxzzlj@whu.edu.cn 张雷, 男, 硕士生, 现从事纳米医学方面的研究. E-mail: zlxzzlj@whu.edu.cn zlxzzlj@whu.edu.cn 2 1 corresp 全红, E-mail:00007962@whu.edu.cn 全红, E-mail:00007962@whu.edu.cn 00007962@whu.edu.cn 2 武汉大学 物理科学与技术学院, 湖北 武汉 430072 武汉大学 物理科学与技术学院, 湖北 武汉 430072 School of Physics and Technology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China School of Physics and Technology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 武汉大学 中南医院放化疗科, 湖北 武汉 430071 武汉大学 中南医院放化疗科, 湖北 武汉 430071 Department of Radiation and Medical Oncology, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China Department of Radiation and Medical Oncology, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 为探究半胱胺修饰的FePt纳米颗粒的抗肿瘤特性, 本文采用化学还原法, 制备出直径约3 nm的FePt纳米颗粒, 再用半胱胺(cysteamine, Cys)重新修饰其表面, 将得到的FePt-Cys纳米颗粒分别与HELF(人胚肺成纤维细胞)和HeLa细胞(人宫颈癌细胞)孵育, 用CCK-8法评估其细胞毒性, 并通过流式细胞仪分析其对两种细胞周期分布的影响.结果发现, 在一定浓度范围内, FePt-Cys纳米颗粒可以显著抑制HeLa细胞的增殖, 但不影响HELF细胞的生长, 其机制可能是通过细胞周期调节作用来产生细胞毒性.基于其对肿瘤细胞显著的杀伤作用和对正常细胞良好的生物相容性, FePt-Cys纳米颗粒将来可能作为一种有效的化疗药剂. In order to investigate the anti-tumor properties of cysteamine (Cys) modified FePt nanoparticles (NPs), a chemical reduction method was implemented to synthesize the 3 nm NPs. With cysteamine remodified, the cytotoxicity of FePt-Cys NPs was studied by CCK-8 assay in HELF (human embryonic lung fibroblast cells) and HeLa cells (human cervical cancer cells). In addition, to explore the detailed cytotoxic mechanism, cell-cycle redistribution analysis was conducted in both cell lines. The results indicate that FePt-Cys NPs could cause significant cytotoxicity in HeLa cells by cell-cycle regulation, but show nontoxicity to HELF cells below a proper concentration in the meantime. Given the remarkable inhibiting effect in tumor cells while a good biocompatibility to normal cells, FePt-Cys NPs could serve as an effective agent in future chemotherapy. FePt-Cys纳米颗粒 HELF细胞 HeLa细胞 细胞毒性 细胞周期调制 FePt-Cys nanoparticles HELF cells HeLa cells cytotoxicity cell-cycle regulation 引言 1 癌症治疗一直以来是困扰公众健康的世界性难题，且已成为我国致死率最高的疾病之一 [ 1 1 , 2 2 ] .手术、化疗和放疗是三种传统的癌症治疗手段，然而，对于重要器官旁生长的恶性肿瘤，手术和放疗都很难彻底地清除病灶.另外，肿瘤细胞普遍会产生耐药性，因而化疗药物也不能完全地抑制肿瘤细胞增殖，且药物本身会损伤正常组织细胞，导致一系列的并发症.因此癌症患者整体存活率不高. 纳米科技的迅速发展为肿瘤的治疗带来了新的希望.由于纳米材料具有独特的表面物化性能、小尺寸效应、高的比表面积和良好的生物相容性等优点，可以用来作为造影剂 [ 3 3 ] 、生物标记 [ 4 4 ] 、肿瘤抑制剂和放疗敏化剂 [ 5 5 ~ 7 7 5~7 ] 等.然而，可以作为肿瘤抑制剂的纳米材料，通常也有和化疗药物一样的缺点，即对正常细胞同样有较大的毒性 [ 8 8 ] .因此，制备出一种兼具抗肿瘤特性且能与正常细胞良好相容的纳米材料显得十分重要，而FePt纳米颗粒的出现为此带来新的机遇. 本文采用化学还原法制备出直径约3 nm的FePt纳米颗粒，用半胱胺重新修饰其表面来加强样品的水溶性.通过CCK-8法评估FePt-Cys对HELF和HeLa细胞的毒性作用，使用流式细胞仪测定其对两种细胞周期分布的影响. 实验部分 1 实验材料 2 氯铂酸(H 2 PtCl 6 ·6H 2 O，分析纯)、硼氢化钠(NaBH 4 ，96%)、无水乙醇(分析纯)、乙酰丙酮铁(Fe(acac) 3 ，98%)、半胱胺(C 2 H 7 NS，95%)、油酸(C 18 H 34 O 2 ，分析纯)、油胺(C 18 H 37 N，90%)和去离子水等，所有分数均代表质量分数. 样品制备 2 将Fe(acac) 3 (0.386 mmol)、油酸(1.5 mL)和油胺(1.5 mL)先后加入到100 mL无水乙醇中，电磁搅拌0.5 h；然后取溶于无水乙醇的H 2 PtCl 6 ·6H 2 O溶液(19.3 mmol/L)20 mL(0.386 mmol)加入到上述混合液中，继续搅拌0.5 h后，缓慢滴加NaBH 4 乙醇溶液(13.14 mmol NaBH 4 溶于200 mL无水乙醇).接着，将反应液加热到40 ℃并持续搅拌2 h，通过离心(8 000 r/min，3 min)和真空干燥(40 ℃，12 h)，即可制得样品. 表面修饰 2 取上述所制样品100 mg，通过超声波降解法溶到100 mL的无水乙醇中，同时将500 mg半胱胺以同样的方法溶入到另一100 mL的无水乙醇中，再将两者混合均匀.对混合液连续超声6 h后，离心干燥得到所需细胞实验样品(FePt-Cys纳米颗粒)，并保存在真空干燥箱中. 样品表征 2 采用超高分辨率透射电子显微镜(UHR-TEM，JEM-2010FEF，JEOL)来观察纳米颗粒的形貌、尺寸和分散度；通过X射线衍射仪(XRD，D8 Advance，Bruker)测试样品的晶体结构(Cu靶， λ ＝0.154 06 nm)；使用傅里叶红外光谱仪(FT-IR，Nicolet 5700，Thermo Nicolet)分析样品的表面化学成分(测量范围为500~4 000 cm -1 ，分辨率为5 cm -1 ). 细胞毒性实验 2 HELF和HeLa细胞均购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，使用RPMI-1640完全培养液(含10%胎牛血清和1%的双抗，每毫升双抗含100个单位青霉素和100 mg链霉素)培养细胞，通过CCK-8法检测FePt-Cys纳米颗粒的细胞毒性.待HeLa细胞生长到对数期时，在96孔板上接种细胞(7 500个/孔)，等待细胞贴壁，依次加入一系列终浓度为0、5、10、15和25 μg/mL的样品溶液(将样品预先超声溶解在RPMI-1640完全培养液中)，在细胞培养箱(37 ℃，5% CO 2 )中孵育24 h之后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育2 h，使用酶标仪(Modulus TM Ⅱ, Turner)检测每孔的OD值(吸光度).实验重复3次以上，结果以平均值±标准差表示.HELF细胞的毒性测试方法同上.OD值与细胞数线性相关，以对照组OD值做归一化，计算细胞存活百分数. 细胞周期测定 2 通过分析FePt-Cys纳米颗粒对两种细胞周期分布的影响来探讨其可能的细胞毒性机制.在6孔板上接种对数期HeLa细胞(30万/孔)，待细胞贴壁后，换无血清的培养液培养细胞6 h，通过饥饿法使接种细胞周期同步化.再使用完全培养液继续培养细胞，给实验组加入样品溶液(终浓度为20 μg/mL).继续孵育24 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两次，再用胰蛋白酶消化收集细胞，并用预冷的乙醇溶液(体积分数70%，1 mL)固定细胞，将细胞放置在-20 ℃的冰箱中保存过夜.之后，将固定好的细胞离心洗涤，使用500 μL PBS缓冲液重悬，加入5 μL 10 mg/mL核糖核酸酶A(RNase A)和25 μL 1 mg/mL的碘化丙啶(PI)，避光孵育30 min后，通过流式细胞仪(Cytomics TM FC 500，Beckman Coulter)测试分析细胞的周期分布结果，实验重复3次以上，结果以平均值±标准差表示.HELF细胞的周期测定方法同上. 结果与讨论 1 材料表征 2 样品的形貌、尺寸和分布通过TEM观察，如 图 1 图 1 所示.油酸油胺作为反应液中的表面活性剂，可以保证反应的稳定进行，同时也能降低纳米颗粒的团聚效应，因而实验制得的FePt纳米颗粒尺寸较小，约为3.2 nm，见 图 1(a) 图 1(a) .如 图 1(b) 图 1(b) 所示，经过半胱胺修饰后，FePt-Cys纳米颗粒的形态近乎是球状的，尺寸约27.3 nm，经过6 h的超声处理，纳米颗粒失去了油酸油胺的保护层，产生了团聚效应. 图 2 图 2 是FePt和FePt-Cys的XRD图谱.从 图 2 图 2 可清楚地看到样品的4个特征峰，分别对应4个特征相面：(111)、(200)、(220)和(311)面，表明实验所制得的纳米颗粒为面心立方结构.样品(111)面对应的特征峰强度明显高于其他三个特征峰，可见纳米颗粒中Fe/Pt原子的密排面确为(111)面 [ 9 9 ] . 由于FePt表面会附着油酸油胺，因而其在水中的分散性极差，采用半胱胺对其表面进行重新修饰，可以改善纳米颗粒在水溶液中的分散性.为验证FePt-Cys表面已连接上半胱胺分子，我们测试了FePt，FePt-Cys和Cys的FTIR光谱，如 图 3 图 3 所示.在光谱中，约3 425 cm -1 处，Cys存在一个N—H键的伸缩振动的吸收峰，源于Cys的亲水基团氨基(—NH 2 )；在约3 345 cm -1 处，FePt也存在N—H键伸缩振动的吸收峰，源于其表面附着的油胺；而FePt-Cys光谱中N—H键伸缩振动的吸收峰位，偏移到约3 405 cm -1 处，且吸收峰的强度比FePt的弱. Cys光谱约660 cm -1 和FePt-Cys光谱约615 cm -1 处均出现C—S键伸缩振动的吸收峰，表明经过超声处理，Cys已连接到样品表面.在约2 500 cm -1 处，Cys存在吸收峰(代表着S—H键的伸缩振动)，而FePt-Cys在此处没有吸收峰，表明连接在纳米颗粒表面的半胱胺分子可能是巯基(—SH)与Fe/Pt原子之间以配位键的形式存在 [ 10 10 ] . 毒性作用 2 从 图 4 图 4 可以看到，FePt-Cys纳米颗粒能够显著抑制HeLa细胞的增殖；在25 μg/mL的测试浓度下，HeLa细胞的活性下降至42.7%，其半致死剂量(IC 50 )约为15 μg/mL.而此时，HELF细胞的生长并没有受到影响. 相对于正常细胞而言，肿瘤细胞普遍具有渗透和滞留增强效应 [ 11 11 , 12 12 ] ，因此纳米颗粒会较多地进入并停留在肿瘤细胞内，从而引发较大的细胞毒性.而正常细胞拥有较低的细胞膜通透性，使纳米颗粒只能少量地进入细胞，在特定浓度下几乎不显现毒性.有研究表明，在一定浓度范围内，FePt纳米颗粒对其他正常组织细胞不显现毒性，如Vero细胞 [ 13 13 ] (非洲绿猴肾细胞)，但能显著抑制肿瘤细胞的增殖，如MCF-7细胞 [ 14 14 ] (人乳腺癌细胞). 2.3对细胞周期分布的影响 2 从 图 5 图 5 可以看到，使用了FePt-Cys纳米颗粒和未使用的HELF细胞的周期变化并不明显，细胞G0/G1期(分裂间期)、S期(DNA合成期)和G2/M期(分裂期)的变化分别为0.25%、0.35%和0.60%.使用了FePt-Cys纳米颗粒的HeLa细胞比未使用的周期有显著变化.细胞G0/G1期、S期和G2/M期的变化分别为6.9%、0.10%和6.8%，细胞被部分阻滞在了G0/G1期，同时看到G2/M期的细胞数占比明显下降.处于分裂期的细胞数急剧下降，意味着产生新细胞的速率严重减缓，即细胞增殖受到显著抑制，这与毒性实验的结果相吻合.有报道表明，纳米金同样可以通过引起HSC-3细胞(人口腔鳞癌细胞)G2/M期占比的下降来产生毒性 [ 15 15 ] .可见，细胞周期调节可能是FePt-Cys纳米颗粒产生细胞毒性的重要机制. 实际上，由于纳米颗粒的团聚效应，FePt-Cys在培养液中的粒径可以达到250 nm [ 9 9 ] , 因而Cys只能保证样品在溶液中稳定分散数十分钟，之后纳米颗粒会慢慢沉降下来，吸附在细胞表面，被细胞摄取 [ 13 13 ] .当大量的纳米颗粒富集在细胞表面时，会导致细胞对培养液中营养成分的代谢速率下降，比如葡萄糖分子可能需要更高的渗透压才能进入细胞.与此同时，细胞对纳米颗粒的摄取会占据细胞膜本身的交换通道，这进一步削弱了细胞的代谢效率.由于缺乏增殖所需的营养因子，细胞生长受到阻滞，进而造成周期上的显著变化，引发毒性反应.这可能是FePt-Cys纳米颗粒引起HeLa细胞周期调节的一种大胆猜想，还需要更多的相关实验进行验证. 结论 1 通过化学还原法，制备出粒径约3 nm的面心立方结构的FePt纳米颗粒，用半胱胺重新修饰其表面后，评估了纳米颗粒的细胞毒性，并测定了样品对细胞周期分布的影响.结果表明，在25 μg/mL的浓度范围内，FePt-Cys纳米颗粒可以显著地抑制HeLa细胞的生长，而正常的HELF细胞的增殖并没有受到影响. HeLa细胞存活率的下降可能是细胞G2/M期占比减少的结果.因此，FePt-Cys纳米颗粒在经过改进后，可能作为一种潜在的化疗药物，用于未来的肿瘤治疗. 参考文献 TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2015, 65 (2): 87-108. DOI: 10.3322/caac.21262. CHEN W Q, ZHENG R S, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66 (2): 115-132. DOI: 10.3322/caac.21338. CHOU S W, SHAU Y H, WU P C, et al. In vitro and in vivo studies of FePt nanoparticles for dual modal CT/MRI molecular imaging[J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132 (38): 13270-13278. DOI: 10.1021/ja1035013. YANG J, EOM K, LIM E K, et al. In situ detection of live cancer cells by using bioprobes based on Au nanoparticles[J]. Langmuir, 2008, 24 (21): 12112-12115. DOI: 10.1021/la802184m. LIU P D, HUANG Z H, CHEN Z W, et al. Silver nanoparticles: A novel radiation sensitizer for glioma?[J]. Nanoscale, 2013, 5 (23): 11829-11836. DOI: 10.1039/c3nr01351k. 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