双酚A对好氧活性污泥中不同酶活性的影响

双酚A对好氧活性污泥中不同酶活性的影响 Effect of Bisphenol A on Various Enzyme Activities in Aerobic Activated Sludge first-author 汪灵伟，男，硕士生，主要从事新型污染物风险评价研究. E-mail:Wang_lingwei@126.com 汪灵伟，男，硕士生，主要从事新型污染物风险评价研究. E-mail: Wang_lingwei@126.com Wang_lingwei@126.com corresp 董玉瑛，E-mail:dong_yuying@163.com 董玉瑛，E-mail:dong_yuying@163.com dong_yuying@163.com 大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600 大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600 College of Environment and Resource, Dalian Minzu University, Dalian 116600, Liaoning, China College of Environment and Resource, Dalian Minzu University, Dalian 116600, Liaoning, China 测定了双酚A对城市污水处理厂好氧活性污泥中脲酶、转化酶、脱氢酶3种酶活性的影响.分析了活性污泥在不同浓度双酚A暴露下的污泥酶活性随暴露时间变化情况，结果显示3种酶活性呈现不同的变化规律.脲酶活性呈现先被抑制随后被激活的抗性酶活性现象；转化酶活性均表现为被激活的趋势，但随暴露时间延长，激活效应不断减弱；脱氢酶活性则表现为持续的抑制效应，且随暴露时间延长，抑制效应明显增大.在双酚A胁迫较低浓度和较短暴露时间，转化酶的活性变化幅度大、响应快，可作为污泥酶活性应激响应的敏感指标，用于双酚A胁迫风险的早期预警. The effects of bisphenol A on urease, invertase and dehydrogenase activities in aerobic activated sludge from municipal wastewater treatment plant were measured. With being exposured in a concentration gradient of bisphenol A, the activity of the 3 enzymes showed different regulation by analyzing enzyme activity of the sludge during different exposure periods. Urease activity was inhibited at first, and then activated, which was owing to the phenomenon of resistance enzyme activity. Invertase activity was always activated, but the change rate of activating effect decreased with the extension of exposure time. Dehydrogenase activity showed persistent inhibitory effect, and the change rate of inhibiting effect increased significantly with the exposure time prolonged. Invertase exhibited obvious and fast responseunder the stress of bisphenol A at lower concentration and shorter time of exposure, thus, it was recommended as a sensitive indicator to stress effect of bisphenol A on sludge enzyme activity for early warning of biological treatment system. 活性污泥 双酚A 脲酶 转化酶 脱氢酶 activated sludge bisphenol A urease invertase dehydrogenase 引言 1 抗生素、化肥农药、产品添加剂等新型污染物来源广、排放量大，可在环境中持久性存在 [ 1 1 ~ 3 3 1~3 ] .这些物质较低浓度存在便影响或抑制生物生存和机能，当其进入污水处理厂，可能导致活性污泥中的微生物活性受到抑制，从而对生物降解过程和效率产生影响 [ 4 4 ] . 双酚A(bisphenol A，简称BPA)作为合成聚碳酸酯、环氧树脂以及生产杀菌剂、抗氧化剂等材料的添加剂，被广泛用于塑料制品中 [ 5 5 ] .它是一种具有雌激素活性的化学品，大量进入环境会扰乱生物体的代谢过程 [ 6 6 , 7 7 ] .目前，国内外的研究多集中于通过驯化好氧活性污泥提高对双酚A的吸附和降解的机制方面，以及微生物优势菌群的筛选 [ 8 8 ~ 11 11 8~11 ] ，而针对新型污染物对污泥生理生化酶指标影响的相关研究报道较少.活性污泥酶活性与城市污水处理工艺运行状况密切相关，脲酶(urease)是一种能促进含氮有机物水解的水解酶，能专一水解尿素，对污水中含氮有机物的分解具有重要意义 [ 12 12 , 13 13 ] .转化酶(invertase)可增加污泥中易溶性营养物质，对污泥中的碳循环有重要作用 [ 14 14 ] .脱氢酶(dehydrogenase)是呼吸链上的主干系酶 [ 15 15 , 16 16 ] .这些酶的活性可作为描述活性污泥性能和功能多样性的重要指标. 本文研究了双酚A对城市污水处理厂好氧活性污泥中脲酶、转化酶、脱氢酶活性的影响，通过分析新型污染物对活性污泥酶活性影响的动力学曲线，希望为控制新型污染物存在对污泥活性的潜在不利影响提供基础数据. 材料与方法 1 仪器和材料 2 UV-1000分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；TDZ5-WSD多管架自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；THZ-B台式恒温振荡器(常州诺基仪器有限公司)；PHP-9082型电热恒温培养箱(上海-恒科技有限公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；溶解氧测定仪(北京哈纳科仪科技有限公司). 双酚A(国药集团化学有限公司)纯度大于99%，其他实验试剂均为国产分析纯.根据双酚A在环境中的浓度范围，设置实验中双酚A暴露浓度梯度在0~5 μg·L -1 . 实验中所用活性污泥均取自大连某污水处理厂的曝气池，其基本理化指标：干重6.19 g·L -1 ；混合液悬浮固体(MLSS) 3 000 mg·L -1 ，挥发性悬浮物(VSS)0.7 mg·L -1 ，污泥容积指数(SVI)80~120 mL·g -1 ；浊度3 500~3 700 mg·L -1 ，耗氧速率3 mg·g -1 ·h -1 . 脲酶的测定方法 2 应用苯酚钠比色法测定脲酶活性 [ 17 17 ] .将污泥与0~5 μg·L -1 浓度梯度双酚A等体积混合.混合后的污泥分别暴露0~25 h，将污泥悬浊液与适量甲苯充分混合，加入10%尿素溶液和柠檬酸缓冲溶液，置于37 ℃恒温培养箱中培养.取出后将混合液过滤.取适量滤液依次加入一定量苯酚钠和次氯酸钠，混匀后静置，溶液呈现靛蓝色，稀释后测其578 nm处的吸光度.以24 h后1 g活性污泥中NH 3 -N的毫克数表示脲酶活性. 转化酶的测定方法 2 应用3, 5-二硝基水杨酸法测定转化酶活性 [ 18 18 ] .将污泥与0~5 μg·L -1 范围内浓度梯度双酚A等体积混合.混合后的污泥分别暴露0~25 h，取一定量污泥悬液加入适量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，10%蔗糖基质溶液和少量甲苯溶液，将此混合液置于恒温培养箱中培养.过滤后取少量滤液，加入适量3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴加热，然后冷却，稀释后于540 nm测吸光度.以1 g烘干污泥24 h生成葡萄糖毫克数表示转化酶活性. 脱氢酶的测定方法 2 应用2，3，5-三苯基氯化四氮唑法测定脱氢酶活性 [ 19 19 ] .将污泥与不同浓度梯度双酚A等体积混合，分别暴露0~25 h.取一定量活性污泥，反复洗涤、离心3次，用生理盐水补足体积后加入少量硫化钠溶液和三氨基甲烷(tris-HCl)缓冲溶液，摇匀后水浴37 ℃加热10 min，加入少量甲醛终止反应，再加入5 mL丙酮水浴保温10 min，离心，取上清液于485 nm处测吸光度，求得三苯基甲臜的生成量，进而求得脱氢酶活性. 结果与讨论 1 双酚A对脲酶的影响 2 图 1 图 1 为不同浓度双酚A胁迫下活性污泥中脲酶活性随暴露时间的变化情况.由 图 1 图 1 可知，不同暴露时间下，脲酶活性呈现出不同的变化趋势，但总的趋势表现为激活效应. 以活性污泥与双酚A最短暴露时间(0.5 h)和最长暴露时间(25 h)为例分析脲酶活性的变化.暴露0.5 h时，脲酶活性明显被抑制，其中，在较高浓度(5 μg·L -1 )暴露的污泥中脲酶活性低于空白组24.2%.脲酶能促进含氮有机物的水解，当活性污泥中存在一定浓度的有毒物质时，可能导致脲酶等水解酶的活性下降，而随着暴露时间的不断延长，脲酶活性逐渐被激活，经最长暴露时间(25 h)后，活性污泥中脲酶活性高出空白组91.7%.根据许晓路等人的研究 [ 20 20 ] ，活性污泥对污水中污染物的降解很大一部分依赖其中的水解酶，污水进入城市污水厂后，活性污泥中水解酶活性均会有所上升.这与本研究中获得污泥脲酶活性随着污染负荷加大被显著激活而升高的趋势相符合. 由较低浓度(1 μg·L -1 )双酚A对活性污泥中脲酶活性的影响可以观察到，在整个实验周期内，脲酶活性随时间的延长呈波浪型变化的趋势，总体变化趋于稳定，其活性相比空白组变化不明显.分析较高浓度(5 μg·L -1 )双酚A对活性污泥中脲酶活性的影响可知，脲酶活性与双酚A的暴露时间呈正相关，其活性显著高于空白组.这种先抑制后激活的现象，也称为“抗性酶活性”现象 [ 21 21 ] ，即当污染物达到一定浓度时，会导致微生物大量死亡，但有小部分微生物能在有毒物质胁迫下生存下来，从而产生对污染物质的抵御能力. 双酚A对转化酶的影响 2 图 2 图 2 描述了双酚A胁迫下活性污泥中转化酶活性随暴露时间的变化.整个实验周期内，随双酚A浓度的逐渐升高，转化酶活性总体呈现显著单调上升趋势，但是在各浓度下转化酶活性相比空白组的升高速率随暴露时间延长逐渐降低.好氧活性污泥与5 μg·L -1 双酚A经最短暴露时间(0.5 h)和最长暴露时间(25 h)，转化酶活性相比空白组分别升高了182.3%和52.5%，其活性变化表现出显著的应激性.微生物受到外界污染物影响时，为减少对自身的毒害，需要通过代谢作用将其分解，此时需要大量的营养物质.转化酶活性升高可为反硝化细菌提供充足的碳源，以供给硝酸还原酶进行生物脱氮，因此，好氧活性污泥中的转化酶在受到污染物干扰的初始过程中会产生明显的激活作用.这种激活作用随着微生物对污染物的适应性增强而逐渐减弱，微生物活性逐渐降低，并最终恢复到稳定状态 [ 22 22 ~ 24 24 22~24 ] .随双酚A与活性污泥暴露时间不断延长，转化酶活性的升高幅度降低，可能由于微生物对污染物的适应性增强，这种激活效应将逐渐减弱，也可能由于双酚A的存在可能会影响微生物的代谢过程，超出其自身承受范围，导致其本身活性下降.综合评价，双酚A对转化酶影响幅度大，可推荐作为表征活性污泥性能的敏感指标. 在较低浓度(1 μg·L -1 )双酚A胁迫下，随暴露时间延长，转化酶变化稳定且平缓，相比空白组其活性未发生显著变化.较高浓度(5 μg·L -1 )双酚A胁迫下，随暴露时间延长，转化酶活性有明显降低的趋势，其活性均高于空白组. 双酚A对脱氢酶的影响 2 图 3 图 3 为不同浓度双酚A胁迫下活性污泥中脱氢酶活性随暴露时间的变化.整个实验周期内，随双酚A浓度的升高，脱氢酶活性总体都被抑制，呈现出显著单调降低趋势.好氧活性污泥与5 μg·L -1 双酚A经最短暴露时间(0.5 h)，脱氢酶活性相对于空白组降低44.0%，表现为抑制效应，且随双酚A与活性污泥暴露时间延长，脱氢酶活性的抑制效应增强；最长暴露时间(25 h)下，脱氢酶活性相对于空白组降低达到89.9%，抑制效应显著. 较低浓度(1 μg·L -1 )双酚A对活性污泥中脱氢酶活性的抑制作用并不明显，表现出良好的耐受性，推测是由于微生物具有主动转运机制，将进入细胞内的有毒物质运输细胞外，稳定自身活性，或通过其他代偿性转运机制，实施和完成合成 [ 25 25 ~ 27 27 25~27 ] .较高浓度(5 μg·L -1 )双酚A对活性污泥中脱氢酶的抑制效果显著，且随双酚A与活性污泥的暴露时间逐渐延长，脱氢酶被抑制的趋势越来越明显.这与隋春晓等人 [ 28 28 ] 的研究结果一致，双酚A胁迫含量较低时，受外界条件刺激下，微生物代谢活性增强，加速双酚A有机物的降解和转化；当双酚A含量过高时，会破坏微生物细胞结构，对微生物产生一定的毒害，降低其氧化代谢能力. 结论 1 本研究测定了双酚A对城市污水处理厂好氧活性污泥中脲酶、转化酶、脱氢酶活性的影响.随双酚A浓度的升高，活性污泥中脲酶对双酚A的响应表现为活性先被抑制后被激活，这种现象符合抗性酶活性规律，体现为表观上的酶活性值降低后增大；转化酶对双酚A的响应表现为显著的激活效应，体现出微生物对污染物的应激性；脱氢酶的变化则体现出微生物的耐受性.在较低双酚A暴露浓度和较短暴露时间，转化酶的活性变化幅度大、响应快，推荐作为污泥酶活性应激响应的敏感指标. 参考文献 王斌, 邓述波, 黄俊, 等.我国新兴污染物环境风险评价与控制研究进展[J].环境化学, 2013(7):1129-1136.DOI:10.7524/j.issn.0254-6108.2013.07.003. 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