唑来膦酸/白介素-2诱导的中国恒河猴外周血γδT细胞体外扩增

唑来膦酸/白介素-2诱导的中国恒河猴外周血γδT细胞体外扩增 In vitro Expansion of Peripheral Blood γδT Cells from Chinese Rhesus Macaque Stimulated by Zoledronate and Interleukin-2 1 first-author 龚 睿，男，副主任技师，博士，现从事微生物和细胞检测研究。E-mail:gongruihb@126.com 龚 睿，男，副主任技师，博士，现从事微生物和细胞检测研究。E-mail:gongruihb@126.com gongruihb@126.com 1 1 2 2 2 2 2 corresp E-mail: zhouli_jerry@whu.edu.cn E-mail: zhouli_jerry@whu.edu.cn zhouli_jerry@whu.edu.cn 湖北国际旅行卫生保健中心，湖北 武汉 430070 湖北国际旅行卫生保健中心，湖北 武汉 430070 Hubei International Travel Healthcare Center, Wuhan 430070, Hubei, China Hubei International Travel Healthcare Center, Wuhan 430070, Hubei, China 武汉大学 动物实验中心动物生物安全三级实验室/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430071 武汉大学 动物实验中心动物生物安全三级实验室/病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430071 Animal Bio-Safety Level Ⅲ Laboratory at Center for Animal Experiments/State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China Animal Bio-Safety Level Ⅲ Laboratory at Center for Animal Experiments/State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 建立了一种培养及大量扩增中国恒河猴外周血γδT细胞的方法。采用Ficoll密度梯度离心法分离中国恒河猴 （rhesus macaque）外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），用含5%猴自体血清、1 000 U·mL －1 白介素-2（IL-2）和不同浓度唑来膦酸（1，5，10 μmol·L －1 ）的OpTmizer细胞培养基进行培养，并使用流式细胞仪进行纯度及表型分析。结果显示：使用含不同浓度唑来膦酸培养基诱导第8 d时，1 µmol·L －1 和5 µmol·L －1 处理组的猴γδT细胞分别扩增至总细胞的91.4%和93.1%；5 µmol·L －1 处理组表达CD56、CD69及HLA-DR蛋白的猴γδT细胞占总细胞的比例分别为75.6%、75.5%以及78.0%；5 µmol·L －1 处理组表达干扰素IFN-γ的猴γδT细胞比例为84.8%。本研究通过优化培养基的组成成分，仅添加猴自体血清和IL-2即能有效诱导猴γδT细胞在体外的大量扩增，且培养得到的猴γδT细胞能够显著表达CD56、CD69、HLA-DR及IFN-γ，并具有较强的免疫激活和细胞杀伤作用。 In this study, we developed a technique for in vitro culture and large-scale expansion of γδT cells from rhesus macaques of China origin. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from rhesus macaque s blood by Ficoll gradient centrifugation, cultured with OpTmizer culture medium containing 5% autologous serum, 1 000 U·mL －1 interleukin-2（IL-2） and zoledronate acid(ZA) with indicated concentration (1, 5, 10 μmol·L －1 ). The purity and typical surface phenotype of monkey γδT cells were analyzed by flowcytometry. The results show that the purity of monkey γδT cells under 1 or 5 μmol·L －1 ZA culture condition is 91.4% or 93.1%, respectively on the 8th day. The expression of CD56, CD69 and HLA-DR on monkey γδT cells are 75.6%, 75.5% or 78.0% with 5 μmol·L －1 ZA stimulation, respectively on the 8th day. In addition, 84.8% of monkey γδT cells could release interferon-γ (IFN-γ) with 5 μmol·L －1 ZA stimulation. To be concluded, this method does not need extra cytokines for growth factor and highly effective for rhesus macaque s PBMC-derived γδT cells large-scale expansion in the OpTmizer culture with autologous monkey serum and IL-2. The cultured Rhesus macaques γδT cells are activated with the high expression of CD56, CD69, HLA-DR on the surface and show the effect of cytotoxicity with inducible IFN-γ releasing. 恒河猴 γδT细胞 唑来膦酸 免疫激活 Chinese rhesus macaque γδT cells zoledronate acid (ZA) immune activation 0　 引 言 1 γδT细胞是同时具备天然免疫和获得性免疫特性的T淋巴细胞 [ 1 1 , 2 2 ] ，主要分布于皮肤、小肠、肺等粘膜以及皮下组织。γδT细胞能分泌干扰素-γ（IFN-γ）而具备免疫杀伤功能，能分泌细胞因子而具有调节免疫系统的功能 [ 3 3 ] ，同时还具备类似自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒作用 [ 4 4 ] ，被证实能够在机体抗病原微生物感染、抑制肿瘤及治疗自身免疫疾病中发挥重要作用。γδT细胞不需要抗原递呈细胞就能对抗原进行处理和递呈 [ 5 5 ] 。因此，培养、扩增、激活γδT细胞的技术对于病原生物学、肿瘤学、免疫学及相关研究工作十分重要。根据δ链的类型，人类的γδT细胞被分为Vδ1和Vδ2两大亚群 [ 6 6 , 7 7 , 8 8 ] ，外周血中的γδT细胞主要为Vδ2T细胞亚型，在机体发生病原体感染时其数量急剧增加，可达血液中白细胞总数的一半以上 [ 9 9 ] 。研究表明，机体的病变细胞或感染细胞能释放甲羟戊酸-胆固醇代谢途径的中间产物磷酸类抗原，如异戊烯焦磷酸单酯（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及其类似物,通过γδT细胞表面受体与之结合，诱导γδT细胞扩增及特异性地激活，并发挥其功能 [ 10 10 , 11 11 ] 。双磷酸盐扩增及特异性地激活γδT细胞的效率更高 [ 12 12 ] ，用时更短，而且临床用药唑来膦酸诱导得到的γδT细胞数量及纯度均较高 [ 13 13 ] 。 尽管已有将实验技术用于人γδT细胞扩增的报道 [ 14 14 ] ，但有关体外培养非人灵长类动物（如中国恒河猴（rhesus macaque））γδT细胞的报道还十分有限。非人灵长类动物已被广泛用作人类疾病的研究模型，如基于中国恒河猴构建的猴艾滋感染模型和/或结核感染模型非常贴近人艾滋和/或结核感染后的病程发展及免疫应答特征 [ 15 15 ] ，且γδT细胞在机体对艾滋及结核感染的免疫应答中都发挥着重要作用，故建立体外培养、扩增、激活中国恒河猴γδT细胞的方法十分必要。本文报道了一种唑来膦酸/白介素-2诱导的体外培养、扩增、激活中国恒河猴γδT细胞的方法，培养的猴γδT细胞活力强、纯度高，具有典型γδT细胞生物学、形态学和免疫学特性。 1　 材料与方法 1 1.1　动物及外周血采集 2 实验用中国恒河猴（简称猴）年龄为5~6岁，体重7~8 kg，雌性，购自湖北天勤猕猴繁育生物科技有限公司，饲养于武汉大学动物实验中心。该中心取得了国际实验动物评估和认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC）的认证（认证号#001274）。所有实验操作程序均经过武汉大学动物实验中心动物使用管理委员会批准，采血前通过肌肉注射（10 mg/kg）氯胺酮将动物麻醉，采集EDTA抗凝静脉血10 mL用于猴外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的分离，同时用促凝剂采血管采集全血5 mL，分离得到猴血清用于细胞培养。 1.2　材料 2 OpTmizer细胞培养基购自Gibco公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自GE Healthcare公司；唑来膦酸（zoledronic acid, ZA）、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和离子霉素（ionomycin）购自Sigma-Aldrich公司；布雷非德菌素（Brefeldin A，BFA）购自eBioscience公司；重组人源白介素-2 （interleukin-2，IL-2）购自PeproTech公司；流式细胞检测所需抗体和染料如 表1 表1 所示。 抗体类型 克隆号 货号 来源 CD3-PerCP-Cy5.5 SP34-2 552852 BD Pharm TCR Vγ9-FITC 7A5 TCR2720 Thermo CD56-PE MY31 556647 BD Bio CD69-APC FN50 560651 BD Bio HLA-DR-PE-Cy7 G46-6 560651 BD Bio IFN- γ -PE 4S.B3 557074 BD Bio 1.3　密度梯度离心法分离猴外周血单核细胞 2 取EDTA抗凝全血（10 mL），用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）倍比稀释，缓慢滴加至Ficoll淋巴细胞分离液上层（稀释血样与Ficoll淋巴细胞分离液体积比为3∶1），离心（1 800 g ，20 min，18~25 ℃）。混合液出现分层，从顶部到底部依次为：血浆层、外周血单核细胞层（可能含有血小板）、淋巴细胞分离液、粒细胞层和红细胞层。用吸管小心吸出介于血浆层与淋巴细胞分离液之间的外周血单核细胞层，转移至15 mL离心管中，用PBS缓冲液对分离出的外周血单核细胞清洗两次（混匀，400 g 离心8 min，4 ℃），再用RPMI 1640细胞培养基清洗一次，然后将外周血单核细胞悬浮于OpTmizer细胞培养液中用于后续实验。若观察到外周血单核细胞中血小板较多，可再采用低速离心（200 g 离心15 min，4 ℃）的方法分离除去血小板。 1.4　ZA/IL-2诱导γδT细胞的体外扩增 2 用含5%猴自体血清、一定浓度的ZA、1 000 U·mL －1 IL-2的OpTmizer细胞培养液及悬浮分离得到的猴外周血单核细胞，并以每孔1×10 6 个·mL －1 置于48孔培养板中培养。每间隔2~3 d，弃去孔中一半体积的旧培养液，添加新鲜的含2%猴自体血清和1 000 U·mL －1 IL-2的OpTmizer细胞培养液，保持细胞浓度在0.5×10 6 ~2.0×10 6 个·mL －1 ，必要时将细胞悬液转移至6孔培养板或T25细胞培养瓶中进行培养。 1.5　流式细胞仪检测分化的猴γδT细胞表型 2 分别在γδT细胞扩增培养的第8 d和第12 d，收集约1.0×10 6 个细胞，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液洗涤2次，加入适量检测γδT细胞的荧光标记抗体，于4 ℃避光孵育20 min，再用PBS缓冲液洗涤2次，重悬于1%多聚甲醛的PBS缓冲液中待检。检测IFN-γ蛋白时，需事先向γδT细胞中加入20 ng·mL －1 PMA，0.5 μg·mL －1 离子霉素及3 μg·mL －1 BFA，置于细胞培养箱中放置6 h。制备好样品后用BD FACSCalibur型流式细胞仪（Becton and Dickinson公司）检测特异性抗体及细胞因子的表达。 2　 结 果 1 2.1　细胞形态学分析 2 猴外周血单核细胞在含5%的猴自体血清的OpTmizer中，使用ZA（5 μmol·L －1 ）/IL-2（1 000 U·mL －1 ）诱导后，在显微镜下观察到γδT细胞增殖明显，结果如 图1 图1 所示。可以观察到，ZA/IL-2诱导后的第3 d、第5 d以及第8 d，细胞呈团样生长，团块较大且密集，第8 d时，聚集的细胞团几乎覆盖整个孔板，需要将细胞转移至6孔板或者T25细胞培养瓶中培养，而对照组细胞（仅添加1 000 U·mL －1 IL-2）成团小，聚集的细胞团疏松稀少。 2.2　培养方法的优化 2 分别以1，5，10 μmol·L －1 ZA/1 000 U·mL －1 IL-2诱导猴外周血单核细胞，第8 d以流式细胞仪检测γδT细胞的表型比例。由 图2 图2 结果可见，ZA浓度为1 μmol·L －1 或5 μmol·L －1 时，γδT表型比例分别达到91.4%或93.1%；而ZA浓度为10 μmol·L －1 时，γδT细胞比例仅为70.3%，与上述两种情况相比，有显著性差异。 统计不同浓度ZA诱导后第8 d和第12 d时γδT细胞表型所占比例，结果如 图3 图3 所示。可知，ZA浓度为5 μmol·L －1 时，诱导效果最好，其次是1 μmol·L －1 浓度的ZA，但当ZA浓度为10 μmol·L －1 时，γδT细胞增殖的效率明显较另两个浓度差。ZA浓度较低时，γδT细胞表型所占的比例在诱导第8 d最高，此后，因其他细胞的增殖速率也在增高，γδT细胞占所有细胞的比例反而下降。 2.3　扩增γδT细胞的激活状态分析 2 CD56蛋白是自然杀伤细胞（NK细胞）的典型表面标志物，是细胞毒作用的标志；CD69和HLA-DRCD56蛋白则是T淋巴细胞免疫激活的标志。检测扩增得到γδT细胞表面是否存在这3种标志物，可用于分析γδT细胞的细胞毒作用以及免疫激活情况。检测方法参考Kondo的工作 [ 14 14 ] ，并作出相应的调整：以5 μmol·L －1 ZA联合1 000 U·mL －1 IL-2诱导猴外周血单核细胞8 d，用流式细胞仪检测γδT细胞表面标志物CD56，CD69以及HLA-DR蛋白的比例。如 图4 图4 所示，CD56，CD69以及HLA-DR阳性的γδT细胞比例分别为75.6%，75.5%以及78.0%，表明由ZA/IL-2诱导得到的γδT细胞具细胞毒作用且处于激活状态。 IFN-γ是由T淋巴细胞和NK细胞产生的细胞因子，具有抗病原体、免疫调节和抗肿瘤的特性。本研究以5 μmol·L －1 ZA/1 000 U·mL －1 IL-2诱导猴外周血单核细胞8 d后，用流式细胞仪检测IFN-γ在猴γδT细胞胞内的表达情况。如 图5 图5 所示，经过PMA/Ionomycin刺激后，84.8%的猴γδT细胞表达IFN-γ，表明由ZA/IL-2诱导得到的γδT细胞具有杀伤细菌的作用。 3　 讨 论 1 体外分选γδT细胞主要是用基于抗体吸附的分选法，但该法所需试剂较昂贵，操作步骤多，容易损耗细胞并造成细胞污染。γδT细胞占外周血中T淋巴细胞的1%~10%，仅依靠分离外周血中的γδT细胞远不能满足免疫学研究及肿瘤学免疫治疗的需求。因此，研究诱导γδT细胞体外分化、扩增的培养方法具重要意义。目前临床上较多使用IPP、IPP类似物及双膦酸盐诱导的人γδT细胞体外扩增 [ 12 12 , 14 14 , 15 15 , 16 16 , 17 17 , 18 18 , 19 19 ] ，但是IPP诱导的方法是否适用于非人灵长类动物γδT细胞体外扩增目前尚无相关报道。Shen等 [ 15 15 ] 应用4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸盐(HMBPP)联合IL-2激活非人灵长类动物γδT细胞。但HMBPP尚未在临床上使用，且该法是否能够诱导非人灵长类动物γδT细胞在体外大量扩增，尚未经过实验验证。ZA作为一种临床上广泛使用的双膦酸盐，已经被证实可以诱导人γδT细胞在体外扩增 [ 14 14 ] ，故本研究选择ZA诱导中国恒河猴γδT细胞扩增。 明确ZA联合IL-2作为诱导物后，本研究使用广泛应用于T淋巴细胞培养且含能提高细胞内谷膀苷肽水平的 N -乙酰-1-半膀氨酸的OpTmizer细胞培养基 [ 20 20 ] 培养猴γδT细胞，并进一步对所需细胞因子进行选择和优化。T淋巴细胞的生长和分化需要相关的细胞因子，为模拟细胞体内的生长环境，本研究选择猴自体血清用于培养，能补充细胞生长所需的自体细胞因子。然而猴自体血清来源有限，如何既保证细胞生长所需的同源细胞因子，又节省猴血清的使用，是本研究面临的问题。本研究结果证明，含有5%猴自体血清（后续培养时将自体血清降至2%）的OpTmizer细胞培养基，完全能保证猴γδT细胞的生长。在培养的第8 d，扩增得到大量聚团的猴γδT细胞。在转移这些聚团的猴γδT细胞时，应注意避免将已经形成细胞团的细胞打散，以免影响细胞的扩增速度。 ZA浓度与γδT细胞扩增效率相关。ZA浓度为1或5 μmol·L －1 时，培养第8 d时猴γδT细胞占比分别达到91.4%或93.1%，ZA浓度为5 μmol·L －1 时，细胞团中猴γδT细胞比例略高；而当ZA浓度为10 μmol·L －1 时，猴γδT细胞比例降至70.3%，表明过高剂量的ZA对猴γδT细胞的生长、扩增具有抑制作用。检测扩增得到的猴γδT细胞的细胞毒作用及激活情况，CD56，CD69以及HLA-DR蛋白阳性的猴γδT细胞比例分别为75.6%，75.5%以及78.0%，表明猴γδT细胞不但处于免疫激活状态且具有细胞毒效能；在PMA和离子霉素的作用下，84.8%的猴γδT细胞表达IFN-γ，表明扩增得到的猴γδT细胞具有细胞杀伤功能。 4　 结 语 1 本研究中使用优化的细胞培养基（含终浓度为5%猴自体血清、5 μmol·L －1 ZA及1 000 U·mL －1 IL-2的OpTmizer细胞培养基）诱导猴外周血单核细胞中γδT细胞扩增、分化，得到具备生物学、免疫学功能的猴γδT细胞。优化过后的细胞培养液中不含异种血清，也未使用除IL-2以外的生长因子，不但降低了实验成本，还能够最大限度地减少不确定因素对实验结果的干扰。此外，猴血清的使用量较低（2%~5%），避免了抽血过度，能最大限度地提高实验动物福利。 参考文献 D’OMBRAIN M C , HANSEN D S , SIMPSON K M , et al . γδT cells expressing NK receptors predominate over NK cells and conventional T cells in the 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