嗜麦芽菌素P28尾鞘基因启动子活性分析

嗜麦芽菌素P28尾鞘基因启动子活性分析 Activity Analysis for Sheath Tail Gene Promoter of Maltocin P28 first-author 于志洋, 女, 硕士生, 现从事普通微生物学研究. E-mail:534827735@qq.com 于志洋, 女, 硕士生, 现从事普通微生物学研究. E-mail: 534827735@qq.com 534827735@qq.com corresp 黄玉屏, E-mail:yphuang@whu.edu.cn 黄玉屏, E-mail:yphuang@whu.edu.cn yphuang@whu.edu.cn 武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072 College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 嗜麦芽菌素P28是由嗜麦芽寡养单胞菌( Stenotrophomonas maltophilia )合成的细菌素，启动子P s 控制其主要结构基因(尾鞘基因和尾管基因)的转录.本研究首先用RACE方法确定嗜麦芽菌素P28的主要结构基因转录起始位点位于尾鞘基因翻译起始位点ATG上游47 bp处的G碱基，然后以 lacZ ( β -半乳糖苷酶基因)为报告基因对201 bp长的启动子P s 从5′端进行缺失突变，发现具有启动活性的最小启动子片段长度为55 bp.当启动子片段截短为89 bp时，启动子P s-89 活性不仅有明显升高，同时不受丝裂霉素C影响.扫描突变分析P s -201 启动子中124 bp与89 bp之间的碱基，结果显示，碱基序列-GTCTG-是P s-201 的关键调控序列，突变后活性提高了2.53倍. Maltocin P28 is a kind of bacteriocin produced by Stenotrophomonas maltophilia . Its two main structural genes, the tail sheath gene and tube gene, are transcribed in one operon. The promoter P s upstream of the tail sheath gene controls their transcription. Using the RACE's method, the transcription initiation site of the tail sheath gene was confirmed at Guanosine (G), which was 47 bp upstream the translation initiation codon ATG. In this study, lacZ ( β -galactosidase) was chosen as a reporter gene to analyze the promoter activity. The length of promoter P s-201 was gradually deleted from 5′-terminal and then serial deletion mutants were constructed. The β -galactosidase activities of recombinant strains show that the shortest length of P s is 55 bp. The promoter activity has a significant increase and is not affected by mitomycin C when the promoter length is shortened to 89 bp. Subsequently, the scanning mutation of nucleotides between 124 bp and 89 bp in P s -201 indicates that the nucleotide -GTCTG- is the key regulatory sequence of P s-201 , as the activity of the mutant increases 2.53 folds. 嗜麦芽寡养单胞菌 嗜麦芽菌素 启动子 调控序列 Stenotrophomonas maltophilia maltocin promoter regulatory sequence 引言 1 嗜麦芽寡养单胞菌( Stenotrophomonas maltophilia )是临床上分离出来的仅次于铜绿假单胞菌及不动杆菌之后的非发酵型革兰氏阴性致病菌 [ 1 1 ] .嗜麦芽寡养单胞菌作为条件病原菌，可感染免疫功能缺陷的患者，引发肺炎、脑膜炎、菌血症等疾病，死亡率最高达69% [ 2 2 ] ，染病后30 d内致死率最高达51% [ 3 3 ] .同时，该菌还具有多耐药性，对头孢类药物、氨曲南类药物、部分氨基糖苷类药物均具有90%以上的耐药率 [ 4 4 ] .随着该菌感染范围的扩大和抗生素的滥用，传统的临床抗生素疗法已经无法很好地治疗该菌感染的疾病 [ 5 5 ] . 本实验室发现嗜麦芽寡养单胞菌P28菌株能产生一种类似于肌尾噬菌体尾部的嗜麦芽菌素P28(maltocin P28)，能杀灭多株嗜麦芽寡养单胞菌，对蛋白酶K、胰蛋白酶和温度敏感，有潜力替代抗生素用于治疗嗜麦芽寡养单胞菌引发的疾病 [ 6 6 ] .maltocin P28合成相关的基因簇(GenBank KC787694)位于P28菌株基因组上，大小约19.9 kb，推测由23个基因组成，所有基因的转录方向一致，其中， orf 17和 orf 18是其主要结构基因，分别编码尾鞘蛋白和尾管蛋白 [ 6 6 ] . 本研究拟通过对 orf 17和 orf 18的启动子P s 进行研究，利用5′端缺失、扫描突变等方法对其活性进行分析，寻找可能的调控序列，为探索maltocin P28的表达调控机制提供理论依据. 材料与方法 1 菌株、质粒与引物 2 S. maltophilia P28菌株由本实验室从土壤中分离得到，对氯霉素敏感.启动子探针载体pBCTZ-Cat携带有氯霉素抗性基因，以 β -半乳糖苷酶( β -galactosidase)基因为报告基因.本研究所用的引物列于 表 1 表 1 . Xho Ⅰ酶切位点：CTCGAG； Hind Ⅲ酶切位点：AAGCTT Primer Nucleotide sequence(5′-3′) Purpose P s-201 -F CTCGAG ACAGCGTCAGCATTTG 扩增201 bp的P s P s-201 -R AAGCTT CATTCGGGGTTCTTCCTC 扩增P s P s-124 -F CTCGAG CCTCCGGCTGGGTCT 扩增124 bp的P s P s-89 -F CTCGAG CTGCAATTATCCCGACCG 扩增89 bp的P s P s-75 -F CTCGAG GACCGCCACATTCTCCGA 扩增75 bp的P s P s-37 -F TCGAG CAAGCCGGCACACACCCACACCGAGGAAGAACCCCGAATGA 扩增37 bp的P s P s-37 -R AGCTT CATTCGGGGTTCTTCCTCGGTGTGGGTGTGTGCCGGCTTGC 扩增37 bp的P s P1 ACCAGCATCGATCCGAAGTGGCAGT 检测 orf 17转录起始位 P2 AGTACGGGCGTGTTGATGGG 点巢式PCR外侧引物 N1 AAACCAAGGTCGGCGAGAAG 检测 orf 17转录起始位 N2 CCATGGAGAAATTCGGTCAT 点巢式PCR内侧引物 主要试剂及仪器 2 试剂：PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和T4 RNA连接酶购自Takara公司；Trizol购自Invitrogen公司；限制性内切酶 Xho Ⅰ和 Hind Ⅲ，Taq DNA和Pfu DNA聚合酶等购自Fermentas公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；DNA凝胶加样缓冲液(DNA 10×loading buffer)、pMD19-T vector试剂盒和DNA Ladder 5000等购自大连宝生物工程公司；质粒小量抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；氨苄青霉素、氯霉素购自北京普博欣生物科技责任有限公司；其他均为国产分析纯试剂. 仪器：5332型PCR仪和5424型高速离心机购自Eppendorf公司；HV-50型全自动高压灭菌锅购自Hirayama公司；SIM-F140AY65型制冰机购自Sanyo公司；SW-CJ-2F型超净工作台购自苏净集团安泰公司. 主要实验溶液 2 LB培养基：称取10 g NaCl、10 g胰蛋白胨和5 g酵母提取物溶解于800 mL水中，调节pH至7.0，定容至1 L.氨苄青霉素(100 mg·mL -1 )：称取1 g的抗生素粉末溶解于10 mL无菌水中，过滤除菌分装成1 mL，保存于-20 ℃.氯霉素(34 mg·mL -1 )：称取0.34 g氯霉素粉末溶解于10 mL无水乙醇中，过滤除菌分装成1 mL，保存于-20 ℃.Z缓冲溶液：称取21.48 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O、4.8 g NaH 2 PO 4 、0.75 g KCl和0.246 g MgSO 4 ·7H 2 O溶解于800 mL水中，调pH至7.0，再加入2.7 mL β -巯基乙醇，定容至1 L.邻硝基苯- β-D -半乳糖苷(ONPG)溶液(4 mol·L -1 )：10 mL Z缓冲溶液中加入0.04 g ONPG粉末，充分溶解. 测定细菌启动子转录起始位点 2 本研究根据Kuhn等 [ 7 7 ] 报道的cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)确定转录本转录起始位点.提取嗜麦芽寡养单胞菌P28菌株的总RNA，用T4 RNA连接酶将mRNA的5′端和3′端连接形成闭合环状，使用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒去基因组并反转录成双链的cDNA；同时在尾鞘基因 orf 17转录本内部设计两对特异性引物，以cDNA为模板，两对引物P1/P2和N1/N2，进行两轮巢式PCR扩增以得到包含未知基因转录本的5′-UTR和3′-UTR序列；连接pMD19-T载体, 转化至大肠杆菌DH5 α 中，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取菌落PCR鉴定正确的转化子测序，根据测序结果确定转录起始位点. 嗜麦芽寡养单胞菌电转感受态制备及电击转化 2 挑取单菌落过夜活化，转接至100 mL液体LB培养基中，30 ℃ 200 r·min -1 培养3.5 h至OD 600 nm =0.5~0.6，冰浴30 min，4 ℃ 5 000 r·min -1 离心5 min，弃上清液，用30 mL 10%冰浴处理的甘油重悬，4 ℃ 5 000 r·min -1 离心5 min，弃上清液，重复3次后用1 mL冰浴的10%甘油重悬菌体，50 μ L分装，-80 ℃保存. 取2 μ L质粒混于50 μ L感受态细胞中，置于冰上5 min后，将混合物加到预冷的0.2 mm的电击杯中，用2.5~3 kV电击4.5~5 ms，迅速加入1 mL液体LB培养基悬浮，30 ℃孵育1 h，取适量菌液涂布氯霉素抗性平板，30 ℃培养36 h，挑取转化子菌落PCR鉴定. 细菌启动子活性的测定 2 本研究以 β -半乳糖苷酶基因( lacZ )为报告基因，通过检测 lacZ 的表达产物来标定目的基因的表达调控 [ 8 8 ] .按1%体积比转接活化过的菌液于液体LB培养基中，30 ℃ 200 r·min -1 培养至OD 600 nm =0.5左右，取1 mL菌液离心，弃上清液后依次加入1 mL Z缓冲溶液，20 μ L 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和40 μ L氯仿，振荡至少20 s，置于30 ℃水浴锅中，加入200 μ L 4 mol·L -1 ONPG溶液，溶液出现微黄后加入500 μ L 1 mol·L -1 碳酸钠溶液终止反应，记录反应时间，12 000 r·min -1 离心10 min后测定上清液的OD 420 nm 和OD 550 nm 值，按照下式计算 β -半乳糖苷酶的酶活性(U·mL -1 )： http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4460747&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4460747&type=small http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=4460747&type=middle 其中： V (mL)为菌液体积， t (min)为反应时间. 结果与分析 1 已有的研究表明， orf 17与下游的 orf 18共转录，与上游的 orf 16不属于同一操纵子 [ 6 6 ] . orf 17与 orf 16编码框之间相隔106 bp，提示 orf 17前存在有启动子P s ，但是使用伯克利果蝇基因组(Berkeley Drosophila Genome Group, http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html )、Tfsitescan( http://www.ifti.org/cgi-bin/ifti/Tfsitescan.pl http://www.ifti.org/cgi-bin/ifti/Tfsitescan.pl )等多个在线预测网站分析P s 启动子序列，均未得到可信度高的启动子区域. 确定 orf 17的转录起始位点 2 提取不同批次 S. maltophilia P28菌株总RNA，共鉴定转化子菌落936株，送测序66株，在 orf 17翻译起始位点ATG上游可比对到32次，其中24个测序结果比对一致，均是47 bp处的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(G).分析结果表明，翻译密码子ATG前47 bp处的G是 orf 17的转录起始位点，并据此推断出 orf 17上游的核糖体结合位点(ribosomal binding sites，RBS)、启动子的-10区和-35区序列，如 图 1 图 1 所示. TGA为 orf 16终止密码子，ATG是 orf 17起始密码子；★：24个测序结果一致的位点 TGA is the termination codon of orf6 ; ATG is the initial codon of orf 17;★:24 sites with consistent sequencing results 确定启动子P s 的最小区域 2 由于 orf 17与上游的 orf 16之间只相隔106 bp，因此，以 orf 17起始密码子ATG上游201 bp片段作为启动子P s 的全长，然后从5′端逐步缺失，启动子P s 分别截短为124，89，75，55 bp和37 bp，测定启动子活性如 图 2 图 2 所示.由 图 2 图 2 可知，P s 长度截短至55 bp时，其活性与201 bp和124 bp启动子相近，而启动子长度缺失至37 bp时，启动子活性非常小，说明启动子P s 具有启动活性的最小长度为55 bp.启动子长度从89 bp逐步缺失到75 bp以及55 bp时，启动子活性逐步降低，则可能是因为75 bp启动子序列中不含-35特征序列，而55 bp长的启动子中不仅没有-35区的特征序列，-10区特征序列也不完整. 比较不同时期启动子P s-124 和P s-89 的启动活性，结果如 图 3 图 3 所示.在细菌生长的不同时期，两种启动子的活性也有所不同，但均在对数中期(mid-log phase)达到最大值，P s-89 在不同生长时期的启动活性均比P s-124 的启动活性强，故推测在89~124 bp之间可能存在着负调控序列. 启动子在丝裂霉素C诱导后的活性变化 2 在P28菌株培养物中加入丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)可以使培养物上清液的杀菌活力增强16倍 [ 9 9 ] ，说明maltocin P28的合成可被MMC诱导.比较不同长度的启动子在诱导(MMC + )与非诱导(MMC - )条件下的启动活性，以确定启动子P s 中与MMC诱导有关的调控序列，结果见 图 4 图 4 .结果显示，在MMC诱导下，P s-201 和P s-124 的启动活性均为非诱导时启动活性的2倍以上，P s-89 和P s-75 几乎已经不受MMC诱导，而对于P s-55 和P s-37 ，MMC诱导后表达量甚至略有降低，推测可能是因为碱基序列较短，已无法应对MMC带来的DNA损伤，影响了自身的表达.由此可知，启动子P s 序列中124 bp至89 bp之间存在一段与MMC诱导相关的调控序列. P s 扫描突变寻找调控序列 2 P s 启动子活性检测结果( 图 3 图 3 )提示在89~124 bp区域之间存在负调控序列.为确定具体的调控序列，以5个碱基为一组，依照A→G，T→C的原则对89~124 bp区域的碱基进行突变，共构建了8个突变体(F 1 ~F 8 )，测定所有重组菌株生长到OD 600 nm =0.5时的活性，然后以P s -201 启动子活性为对照，计算各菌株的酶活性比值，结果见 图 5 图 5 .以P s-201 活性为对照，突变子P s-F5 启动子活性提高了2.53倍( p < 0.05)，说明原始的5个碱基(-GTCTG-)是关键负调控序列，突变后抑制作用减弱，导致启动活性大幅升高.然而突变子P s-F 2 和P s-F 7 的启动子活性分别降低至P s -201 启动子的0.75倍( p < 0.05)和0.77倍( p < 0.05)，推测是因为改变了较为保守的碱基或者此处为正调控区域所导致.但从 图 2 图 2 知P s-89 启动子的活性高于P s-124 启动子的活性，说明P s-F5 突变的序列负调控作用较强.P s-F5 在MMC诱导与非诱导条件下的活性相差无几，说明P s-F5 突变的序列也是MMC诱导调控的关键序列. 讨论 1 一般来说，细菌素的产生是受到严格调控的，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌合成细菌素的调控机制明显不同.革兰氏阳性菌合成细菌素的调控多为与群集感应(quorum sensing)有关的双组分调节系统(two-component regulatory system).例如，变异链球菌( Streptococcus mutans )合成变异链球菌素(mutacin)是由双组分调节系统ComDE控制，通过群体感应信号肽诱导产生的 [ 10 10 ] ；而革兰氏阴性菌合成细菌素的调控则主要与细菌的SOS系统相关，如铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa )合成脓菌素(pyocin)是通过SOS系统中的激活蛋白RecA和阻遏蛋白LexA来调节 [ 11 11 ] . 铜绿假单胞菌产生的脓菌素(pyocin)有 R -型、 F -型和 S -型三种类型，在pyocin S1，S2，AP41，S3和R2的编码基因5′端非编码区均存在一段由10~12个碱基组成的序列ATTGNN( n )GTNN( n )，称为P-box [ 12 12 ] ，是激活蛋白PrtN的结合位点.自然状态下，阻遏蛋白PrtR抑制 prtN 基因的表达，导致pyocin不能大量合成；当受到MMC诱导后，被激活的RecA切割PrtR蛋白，使 prtN 基因得以表达并结合P-box，激活pyocin结构基因的表达 [ 13 13 ] .P-box在不同启动子中出现频率不同，如在 S -型pyocin启动子中重复出现了4次，而在R2-pyocin中重复出现了2次 [ 14 14 ] . 将本研究嗜麦芽菌素P28的P s 启动子序列与上述几种pyocin结构基因的5′端非编码区进行比较，结果如 图 6 图 6 所示.在P s 启动子中也发现4对类似P-box的序列，位置集中于55~89 bp之间.如果P s 中类似P-box的序列如同P-box一样，为激活子结合位点，那么在MMC诱导下P s-89 启动子的活性应该显著升高，而实验结果显示P s-89 酶活性与未诱导时相当，说明P s 中发现的类似P-box的序列未发挥调控作用. 结论 1 嗜麦芽寡养单胞菌分布极其广泛，江河湖泊、动植物和人体内均存在.广泛的分布、广谱的耐药性和高致死率，使得治疗该菌引起的疾病已经成为一大难题.嗜麦芽寡养单胞菌是寡养单胞菌属中已知的惟一可以致病的菌种 [ 15 15 ] ，嗜麦芽菌素P28是嗜麦芽寡养单胞菌中首个分离出来的细菌素 [ 9 9 ] .本研究对嗜麦芽菌素P28主要结构基因启动子P s 的活性进行了详细分析.利用RACE法确定主要结构基因转录起始位点为翻译密码子上游47 bp处G碱基；通过一系列缺失突变和扫描突变分析确定了在89~124 bp之间碱基序列-GTCTG-是关键负调控序列，同时此序列也与MMC诱导嗜麦芽菌素P28的表达调控相关，而与铜绿假单胞菌合成脓菌素时的调控序列P-box [ 16 16 ] 完全不同，且P s 上发现的P-box与MMC诱导无关.本研究对嗜麦芽菌素P28结构基因启动子P s 的活性分析有助于了解嗜麦芽菌素P28的合成机制，从而为开发利用嗜麦芽菌素P28治疗嗜麦芽寡养单胞菌感染提供理论依据. 参考文献 JONES R N. 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