基于链置换扩增反应与DNA银簇的免标记核酸检测方法

基于链置换扩增反应与DNA银簇的免标记核酸检测方法 A Label-Free Detection Method for Nucleic Acid Based on Strand Displacement Amplification Reaction and DNA Silver Nanoclusters 1 first-author 张瑶，女，硕士生，主要从事DNA-银纳米簇的合成与检测方面的研究. E-mail:zyao_24@163.com 张瑶，女，硕士生，主要从事DNA-银纳米簇的合成与检测方面的研究. E-mail: zyao_24@163.com zyao_24@163.com 1 2 1 2 1 2 corresp 钱和, E-mail:amtf168@126.com 钱和, E-mail:amtf168@126.com amtf168@126.com 江南大学 食品学院/食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122 江南大学 食品学院/食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122 School of Food Science and Technology, Jiangnan University/State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, Jiangsu, China School of Food Science and Technology, Jiangnan University/State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, Jiangsu, China 江南大学 食品安全国际联合实验室，江苏 无锡 214122 江南大学 食品安全国际联合实验室，江苏 无锡 214122 International Joint Laboratory of Food safety, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China International Joint Laboratory of Food safety, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 提出一种基于链置换扩增反应(SDA)和DNA银簇合成的免标记核酸检测方法.该方法分为两步：第一步，模板链(TemDNA)特异性识别目标链(TarDNA)并利用链置换扩增反应扩增出银链(AgDNA)；第二步，将扩增后的AgDNA链与硝酸银合成DNA银簇，再根据产物的荧光强度实现定量检测.该方法在0~1 200 nmol·L －1 浓度范围内对目标DNA具有良好的线性响应，检出限达540 pmol·L －1 ，且可以根据不同的目标DNA修改模板序列. A novel label-free method to detect target DNA based on strand displacement amplification(SDA) and synthesis of silver nanoclusters (AgNCs) was developed. This method consisted of two steps: 1) the target DNA (TarDNA) was recognized specially by the template DNA (TemDNA) and then amplified a lot of Ag-strand (AgDNA) using strand displacement amplification reaction (SDA); 2) amplified AgDNA was used to synthesize DNA silver nanoclusters with silver nitrate. Then the synthesized product could be quantitatively detected according to the fluorescence intensity. This detection shows a good liner response to the target DNA in the range of 0-1 200 nmol·L －1 , and the detection limit reaches 540 pmol·L －1 . Furthermore, the template DNA sequence can be modified on the basis of different target DNA sequence. 链置换扩增反应 银纳米簇 荧光强度 DNA聚合酶 限制性内切酶 strand displacement amplification reaction (SDA) silver nanoclusters (AgNCs) fluorescence inten- sity DNA polymerase restriction enzyme 引言 1 DNA是构成生命体的基本大分子，引导着生物发育与生命机能运作.每一种生物都有其独一无二的DNA序列，储存着生物的遗传信息.随着科学研究的不断深入，对于特定DNA序列的扩增与检测方法层出不穷.常规的聚合酶链式反应(PCR)，作为一种目前比较流行的分子生物学诊断技术，可以高灵敏地检测DNA序列.但PCR方法基于热循环过程，需经历几十个变温循环过程，依赖于精密的温度程序控制仪器，且检测结束后需制备电泳凝胶、添加溴化乙锭等有毒荧光染料，设备昂贵，操作繁琐 [ 1 1 ] .基于不同活性核酸酶的等温核酸放大检测方案，如基于连接酶和聚合酶的滚环扩增反应(RCA) [ 2 2 ] 、聚合酶和限制性内切酶的链置换扩增反应(SDA)等 [ 3 3 ] ，由于灵敏度高、耗时短、不依赖于温控仪器等优势，成为近年来的研究热点.许多具有特异活性的工具酶，如核酸外切酶1(Exo Ⅰ) [ 4 4 ] 、核酸外切酶3(Exo Ⅲ) [ 5 5 ] 、限制性内切酶(NEase) [ 6 6 ] 、聚合酶(polymerase) [ 7 7 ] 、连接酶(ligase) [ 8 8 ] 等被用于设计不同的等温核酸扩增检测方案，构建荧光、比色、电化学等高灵敏核酸检测方法. 银纳米簇(silver nanoclusters, AgNCs)是一种粒径在几纳米到几十纳米之间的超微纳米材料，具有光致发光性质或催化活性 [ 9 9 ] .AgNCs在室温下液相中即可大量合成，其发射波长覆盖了可见光至近红外波长区域，广泛应用于分析化学、生物医学检测、细胞成像等领域 [ 10 10 ] .以DNA为模板合成的AgNCs具有相应的生物反应/识别功能 [ 11 11 ] ，在低成本核酸检测中具有很大的应用潜力. 本文构建了一种基于链置换扩增反应及银簇合成检测特定DNA序列的新方法.在该方法中，第一步，待测的目标DNA链(TarDNA链)作为引物，在DNA聚合酶和限制性内切酶的作用下，引导与模板DNA链(TemDNA)互补的AgDNA合成和替换，从而使得AgDNA被循环扩增；第二步，被扩增的AgDNA与硝酸银合成DNA银簇，在特定波长的激发光下产生荧光信号，从而实现对目标DNA的定量检测. 实验部分 1 材料、试剂及仪器 2 实验中所用的DNA序列均购自生工生物工程(上海)技术有限公司，列于 表 1 表 1 .Klenow Fragment(3′→5′ exo-)聚合酶、 Nt.Bbvc Ⅰ限制性内切酶、10×CutSmart缓冲液和dNTP均购自NEB(北京)有限公司.GelRed核酸染料(10 000×)、6×上样缓冲液均购自天津迈基生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、冰乙酸、Na 2 EDTA·2H 2 O、AgNO 3 、NaBH 4 均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司.实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm). 序列名称 序列 TarDNA 5′-GTCACTCGACGCCATC-3′ TemDNA 5′-GGGGATTAAGGGTTTTTAGTCACCCCAACCTGCCGCTGAGGGA TGGCGTCGAGTGAC-3′ AgDNA 5′-GGCAGGTTGGGGTGACTAAA AACCCTTAATCCC C-3′ WP1 5′- GTCAAGTCACGCGTCA -3′ WP2 5′- AGTCCTCGTACGCATC -3′ 50×TAE储备缓冲液的制备：称取242 g Tris、37.2 g Na 2 EDTA·2H 2 O于烧杯中，加入800 mL超纯水，充分搅拌至溶解后，加入57.1 mL的冰乙酸，充分混匀，加入超纯水定容至1 L，即得50×TAE储备缓冲液. 实验用主要仪器：RF-6000型荧光光谱仪(日本岛津公司)，UV-1800型紫外分光光度计(岛津公司)，DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪(北京六一仪器厂)，Tanon5200Multi型荧光成像仪(上海天龙仪器制造厂). 实验方法 2 链置换扩增反应 3 链置换扩增反应总体系为50 μ L：先加入2 μ L TarDNA(100 μ mol·L －1 )和2 μ L TemDNA(100 μ mol·L －1 )，于95 ℃热水浴中加热5 min后缓慢冷却.然后，加入5 μ L CutSmart(10×)缓冲液，10 μ L dNTP(10 mmol·L －1 )，2 μ L Klenow Fragment(3′→5′ exo-)酶(5 000 U/mL)，1 μ L Nt.Bbvc Ⅰ酶(10 000 U/mL)，用超纯水补足至50 μ L.混合均匀，置于37 ℃温育5 h.最后在80 ℃热水中加热10 min灭酶活性. DNA银簇合成 3 银簇合成总体系为200 μ L.在上述链置换扩增反应产物中加入126 μ L水，20 μ L PB缓冲液(100 mmol·L －1 ，pH 7.0)，2 μ L AgNO 3 溶液(3.0 mmol·L －1 )，混合均匀后在4 ℃下避光保存10 min，加入2 μ L新鲜配制的NaBH 4 (3.0 mmol·L －1 )，置于室温下避光反应9 h. 琼脂糖凝胶电泳 2 用1×TAE缓冲液制作浓度为2.0%的琼脂糖凝胶，将DNA与6×上样缓冲液混合后，取3 μ L于点样孔中，在80 V电压下进行电泳分析50 min.电泳缓冲液采用1×TAE缓冲液.DNA染色使用GelRed核酸染料(1×)进行前染色.电泳结束后在荧光成像仪下观察. 荧光光谱检测 2 采用荧光光谱仪检测DNA银簇的荧光强度，激发波长为500 nm，激发光和发射光的狭缝宽度均设置为10 nm. 结果与讨论 1 DNA银簇合成机制 2 DNA银簇合成机制如 图 1 图 1 所示.第一步(Ⅰ)：待检测的TarDNA与TemDNA互补配对，在聚合酶Klenow Fragment (3′→5′exo - )的作用下延伸合成与模板链互补配对的AgDNA.然后，限制性内切酶 Nt.Bbvc Ⅰ找到双链DNA上的特异性识别位点，并在该处产生切口，随后聚合酶在此处继续延伸合成AgDNA链，并将之前的AgDNA链替换下来.如此循环切割-合成-替换，便可扩增出大量用于银簇合成的AgDNA链.第二步(Ⅱ)：AgDNA链与硝酸银在室温下合成DNA银簇，最终在荧光光谱仪下检测，即可根据荧光强度定量检测待测DNA. 电泳表征 2 链置换扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果如 图 2 图 2 所示. 在扩增过程中，TarDNA与TemDNA结合后便不再分开，因此分子量最大，电泳距离最短.由 图 2 图 2 可以看出，扩增产物泳道有两条荧光条带，下边一条对应于TarDNA和TemDNA的结合产物，上边一条对应AgDNA链，说明扩增产物为银簇合成所需的AgDNA链. DNA银簇合成条件优化 2 银簇合成时间 3 分别测定了3，6，9，12，16，24 h时的银簇荧光强度以确定其最佳合成时间，结果如 图 3 图 3 所示.可知，银簇在9 h时荧光强度最强，故选择9 h为最佳合成时间. 背景信号 3 当TarDNA浓度为0时，所合成的银簇依旧有一定的荧光强度，这一现象的产生是由于TemDNA与银合成的银簇产物所产生的微弱荧光所致，这些背景信号对检测信号形成一定的干扰.为了消除背景信号对检测的影响，设计如下方案：实验组加入2 μ L TemDNA(100 μ mol·L －1 )+2 μ L AgDNA(100 μ mol·L －1 )；对照组只加入2 μ L TemDNA(100 μ mol·L －1 )，先经历退火阶段：加热至90 ℃再自然冷却至室温，之后进行DNA银簇合成，再于500 nm处检测两组样品的荧光强度.由于AgDNA与TemDNA互补配对，在退火后两条链便可以结合在一起成为双链DNA.当不存在TarDNA链时，互补配对的AgDNA不会被置换下来，双链DNA结构会一直保持.而双链DNA不与银合成银簇，故荧光强度下降，空白背景信号得到一定程度的降低，结果如 图 4 图 4 所示.可以看出，实验组(曲线b)的荧光强度峰值，相较对照组(曲线a)的荧光强度峰值下降了近一半.从而可以证明该实验方法可以有效降低空白背景信号，提高本实验方法的检测灵敏度.在接下来的线性实验中，每组均使用该实验方案降低背景信号. DNA银簇的荧光检测 2 线性范围及检出限 3 在第一步链置换扩增反应中分别加入了终浓度为0，5，25，50，100，200，400，800，1 200 nmol·L －1 的TarDNA，扩增产物与银簇合成后进行荧光强度的测定.如 图 5A 图 5A 所示，随着初始TarDNA浓度的不断增加，最终合成银簇的荧光强度也在不断增强，荧光发射峰值出现在590 nm处.取每一TarDNA浓度的峰值荧光强度值减去空白背景信号强度值与对应浓度作线性关系曲线，如 图 5B 图 5B 所示.590 nm处各荧光强度与初始TarDNA浓度呈现良好的线性关系， R 2 =0.991 5.经计算，检出限达到540 pmol·L －1 . 选择性 3 选择与原目标链TarDNA同等长度但不与TemDNA完全互补的两条DNA序列WP1和WP2作为待测链进行链置换扩增反应，以检测链置换扩增反应对TarDNA响应能力的选择性，其电泳图如 图 6 图 6 所示.可以看到，两条样品泳道均只有一条荧光条带，位置与TemDNA对应，说明以WP1和WP2为待测目标链进行链置换扩增反应时，没有得到所需的AgDNA，证明仅当待测的TarDNA序列存在时，链置换扩增反应才会扩增出用以银簇合成的AgDNA链. 将不与模板链互补配对的WP1、WP2序列作为实验组，与模板链互补配对的TarDNA序列作为对照组，进行链置换扩增反应，之后进行银簇合成，产物的荧光强度检测结果如 图 7 图 7 所示.可以看出，以WP1、WP2序列为引物的实验组在590 nm处的荧光强度明显低于对照组TarDNA序列的荧光强度，实验组的荧光强度均处于空白信号强度范围.实验结果进一步说明仅当待检测的TarDNA存在时，链置换扩增反应才会发生，才能扩增出用以银簇合成的AgDNA链，即模板链对待测的DNA序列具有良好的选择性. 结论 1 本文构建了基于等温扩增和DNA银簇的核酸检测方法.该检测方法首先进行链置换扩增反应得到大量AgDNA序列，然后AgDNA序列与银簇合成DNA银簇，根据银簇的荧光发射峰强度检测待测的TarDNA序列浓度.DNA银簇的荧光强度在一定范围内与待测DNA浓度在0~1 200 nmol·L -1 范围内呈现良好的线性关系( R 2 =0.991 5)，检出限为540 pmol·L -1 ，且链置换扩增反应对待测DNA序列具有较好的选择性.本方案采用银簇合成实现了免标记检测，同时结合等温扩增技术实现快速扩增，操作简单高效.而且本检测方法的模板链DNA可以根据待测DNA序列的不同而改变设计，因此，理论上这是一种可以检测不同DNA序列的检测方法.本文虽然进行了相关背景信号的条件优化，但仍旧存在一定的背景信号干扰，后续研究工作将进一步优化检测方法，降低背景信号，以提高检测方法的灵敏度. 参考文献 张捷, 许美玲, 王璇, 等. 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