一锅法制备萘酰亚胺类pH荧光探针

一锅法制备萘酰亚胺类pH荧光探针 One-Pot Preparation of Naphthalimide pH Fluorescent Probe 1 2 first-author 刘敏，男，硕士生，现从事核酸及荧光探针研究.E-mail: liumininwhu@whu.edu.cn 刘敏，男，硕士生，现从事核酸及荧光探针研究.E-mail: liumininwhu@whu.edu.cn liumininwhu@whu.edu.cn 3 1 2 1 2 corresp 杜宇昊, E-mail:dyh@whu.edu.cn 杜宇昊, E-mail:dyh@whu.edu.cn dyh@whu.edu.cn 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 武汉大学 生物医用高分子材料教育部重点实验室，湖北 武汉 430072 武汉大学 生物医用高分子材料教育部重点实验室，湖北 武汉 430072 Key Laboratory of Biomedical Polymers of Ministry of Education, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China Key Laboratory of Biomedical Polymers of Ministry of Education, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 迈阿密大学 化学与生物化学系，俄亥俄州 牛津 45056 迈阿密大学 化学与生物化学系，俄亥俄州 牛津 45056 Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford 45056, Ohio, the United States of America Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford 45056, Ohio, the United States of America 以4-溴-1, 8-萘二甲酸酐为骨架，利用两分子1-(2-氨乙基)吡咯烷作为亲核试剂，采用一锅法合成一种萘酰亚胺类pH荧光探针Daepna，用核磁共振谱和质谱对产物进行表征，并检测了其不同pH值条件下的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱.实验结果表明：该荧光pH探针在较宽的pH范围(2.0~11.0)内有着较灵敏的响应，在紫外灯的照射下可直接用于pH值的可视化检测；具有良好的光稳定性，紫外光照30 min内荧光维持恒定；具有较好的抗金属离子干扰性，5种常见金属离子(Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Mg 2+ , Zn 2+ )对其荧光强度变化的影响均在20%以内. A naphthalimide-based pH fluorescent probe was synthesized by one-pot method using 4-bromo-1, 8-naphthalic anhydride as the backbone and 1-(2-aminoethyl) pyrrolidine as the nucleophile. The product was cha- racterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry. UV-Vis absorption spectra and fluore- scence emission spectra under different pH values were determined. The pH fluorescent probe exhibits a sensitive response over a wide pH range (2.0-11.0), and it can be used for the visual detection for pH values under UV light irradiation. The fluorescence of the probe remains constant within 30 minutes UV light irradiation, showing strong stabi- lity. The presence of common metal cations such as Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Mg 2+ , and Zn 2+ has no significant effect on the fluorescence (less than 20%), displaying strong anti-metal ions interference capability. 荧光探针 pH检测 4-溴-1, 8-萘二甲酸酐 fluorescent probe pH detection 4-bromo-1, 8-naphthalic anhydride 引言 1 pH值在多种生命活动中扮演着重要的角色，如信号转导、离子转运、胞吞、细胞增殖等.因此，调节和稳定pH值对于细胞维持活力至关重要 [ 1 1 ] .正常生理条件下，生命体的细胞质pH(pH c )和细胞外pH (pH e )分别为7.2和7.4左右 [ 2 2 ] .而不同细胞器中的pH值也各不相同.例如，溶酶体中的pH值在4.5~5.5之间，而线粒体中的pH值大约是8.0 [ 3 3 ] .异常的pH值会导致整个细胞稳态的破坏，引起细胞损伤，如自由基的产生、膜收缩性的破坏、异常的细胞凋亡和坏死等 [ 1 1 ] .因而，检测细胞内pH值对于掌握细胞的健康状态具有重要意义. 荧光光谱法检测细胞pH值具有无创、高灵敏度、高选择性、快速响应、实时监控、原位观测等优点 [ 4 4 ] ，在生物、医药等研究领域受到广泛关注.近年来，研究人员开发了许多不同类型的pH荧光探针及传感器，如基于有机金属框架(MOFs) [ 5 5 ] 、量子点 [ 6 6 ] 、氧化铱感应膜 [ 7 7 ] 、碳纳米点 [ 8 8 ] 、纳米晶体 [ 9 9 ] 的pH传感器，以及各式各样的化学小分子pH荧光探针 [ 10 10 ~ 17 17 10~17 ] .这些荧光探针及传感器性能优良，各具特点，有的具有靶向性，有的发射波长位于近红外区，有的可以在强酸条件下工作.然而，这些探针中的大多数都需要相对复杂的制备步骤. 萘酰亚胺类衍生物是一类重要的荧光材料，其分子中通常同时具有强的给电子基团和强的吸电子基团，能够形成“吸-供电子共轭体系”，可以在光的照射下产生强烈的荧光，在荧光染料、荧光增白剂、太阳能聚集器、液晶、激光、有机光导材料等领域有着广泛的应用 [ 18 18 ] .通常，以4-溴-1, 8-萘二甲酸酐为骨架的萘酰亚胺类荧光探针至少需要两步反应合成，一步取代酸酐结构上的O，一步取代Br，一般无法通过一锅法合成此类荧光探针 [ 19 19 ] . 武汉大学学报(理学版)第64卷第4期刘敏等：一锅法制备萘酰亚胺类pH荧光探针本研究设计了一种以4-溴-1, 8-萘二甲酸酐为骨架，一锅法合成萘酰亚胺类pH荧光探针的简单方法，采用核磁共振谱和质谱对产物进行表征，并研究了其不同pH值条件下的紫外-可见吸收及荧光发射性能，测试了它对水溶液pH值的响应、光稳定性以及对pH的选择性，为其应用于细胞pH的临床检测进行初步探索. 实验部分 1 试剂及仪器 2 试剂：4-溴-1, 8-萘二甲酸酐(4-bromo-1, 8-naphthalic anhydride，化学纯)、1-(2-氨乙基)吡咯烷(1-(2-aminoethyl) pyrrolidine，化学纯)、乙二醇单甲醚、二氯甲烷、甲醇、CaCl 2 、CuCl 2 、FeCl 3 、MgCl 2 、ZnCl 2 等均为分析纯；柱层析用硅胶(200~300目)；实验用水为超纯水(18 MΩ·cm)； 仪器：LS 55型荧光分光光度计(PerkinElmer公司)；UV-2500型紫外可见分光光度计(Shimadzu公司)；1220-6120型单四级杆液质联用仪(Agilent公司)；Ascend型液态核磁共振仪(400 MHz，Bruker公司)；RV10 basic型旋转蒸发仪(IKA公司)；RCT basic磁力搅拌器(IKA公司)；GL-9406型手提式紫外灯(南京温诺仪器公司). 合成方法 2 该pH荧光探针Daepna的合成路线见 图 1 图 1 .将4-溴-1, 8-萘二甲酸酐(138.6 mg, 0.502 2 mmol)加入到10 mL圆底烧瓶中，再加入5 mL乙二醇单甲醚，充分溶解后，加入1-(2-氨乙基)吡咯烷(0.3 mL, 2.369 mmol).将反应体系温度设为140 ℃，回流搅拌3 h.通过薄层色谱法(TLC)监测反应进程，待4-溴-1, 8-萘二甲酸酐完全反应完，停止反应，冷却，旋转蒸发溶剂，用硅胶柱层析法(CH 2 Cl 2 :CH 3 OH, 10:1)纯化产物，得到黄色固体产物pH荧光探针Daepna 151.0 mg，产率约为74%. 不同pH值条件下的紫外-可见吸收光谱检测 2 先将探针Daepna溶于二甲基亚砜(DMSO)，得到10 mmol·L -1 的母液，再用不同pH值的PBS(磷酸盐)缓冲液(pH值分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0)稀释，得到不同pH值条件下的样品溶液(5 μ mol·L -1 ).每次取200 μ L样品溶液，加入到光程为1 cm的紫外比色皿中，以200 μ L相应pH值的PBS缓冲液为参比，设置狭缝宽度为5 nm，在300~550 nm波长范围内进行紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱的扫描，考察不同pH值条件下探针Daepna的紫外-可见吸收性能. 不同pH值条件下的荧光发射光谱检测 2 每次取200 μ L按1.3节方法配制的不同pH值样品溶液，加入到光程为1 cm的荧光比色皿中，设置激发波长330 nm，激发狭缝10 nm，发射狭缝15 nm，在365~650 nm波长范围内进行荧光发射光谱的扫描. 避光条件下，利用手提式紫外灯(365 nm)直接照射不同pH值(10.0，8.0，7.0，6.0，5.0，3.0)样品溶液的EP管，观察其发光现象. 光稳定性实验 2 在1.3节方法所配制的样品溶液中，取200 μ L pH 3.0的样品溶液(5 μ mol·L -1 )，设置激发狭缝10 nm，发射狭缝15 nm，用330 nm的激发光连续对其照射30 min，选用动力学模式，记录其最大发射波长处(530 nm)荧光强度的变化. 抗干扰性实验 2 先配制好浓度为10 mmol·L -1 的CaCl 2 ，CuCl 2 ，FeCl 3 ，MgCl 2 ，ZnCl 2 溶液.然后在1 mL的pH值为4.0和8.0的PBS溶液中分别加入0.1 μ L浓度为10 mmol·L -1 的pH荧光探针Daepna母液，再分别加入5 μ L上述金属离子溶液，使pH荧光探针的终浓度为1 μ mol·L -1 ，金属离子的终浓度为50 μ mol·L -1 . 每个样品取200 μ L，采用330 nm的激发波长，设置激发狭缝10 nm，发射狭缝15 nm，测量其荧光发射光谱，记录最大波长处(530 nm)的荧光强度. 结果与讨论 1 结构表征 2 pH荧光探针Daepna的核磁共振氢谱( 1 H NMR)、碳谱( 13 C NMR)如 图 2 图 2 、 图 3 图 3 所示，对应数据以及质谱数据如下： 1 H NMR(400 MHz, DMSO) δ : 8.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar— H ), 8.47 (d, J = 7.3 Hz, 1H, Ar— H ), 8.30 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar— H ), 7.85 (t, J = 5.3 Hz, 1H, N H ), 7.78~7.67 (m, 1H, Ar— H ), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar— H ), 4.24 (s, 2H, NHC H 2 ), 3.62 (d, J = 5.4 Hz, 2H, NC H 2 ), 3.14~2.70 (m, 12H, N(C H 2 ) 3 ), 1.81 (d, J = 18.3 Hz, 8H, CH 2 C H 2 CH 2 ). 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ : 164.27 (s, C7), 163.37 (s, C8), 150.92 (s, C18), 134.75 (s, C12), 131.22 (s, C11), 129.89 (s, C17), 129.20 (s, C13), 124.81 (s, C9), 122.27 (s, C15), 120.58 (s, C16), 108.17 (s, C10), 104.33(s, C14), 54.16 (d, J = 6.8 Hz, C3, C4, C21, C22), 53.71 (s, C20), 53.50 (s, C6), 42.01 (s, C19), 38.29 (s, C5), 23.54 (s, C1, C2, C23, C24). C 24 H 30 N 4 O 2 质谱：计算值(M+H) + : 407.2, 实测值：407.2. 通过核磁共振谱图及质谱图的表征，可以确定成功合成了目标产物Daepna. 紫外-可见光吸收性能 2 首先测定了产物Daepna在不同pH值条件下的紫外-可见吸收光谱.如 图 4 图 4 所示，探针Daepna的紫外-可见吸收光谱与pH值的变化呈负相关性.在酸性条件下(pH 2.0~6.0)，探针Daepna的最大吸收峰出现在434 nm处，吸收峰的强度随着pH值的逐渐增大而不断降低；在中性和碱性条件下(pH 7.0~11.0)，探针Daepna的吸收峰逐渐红移，当pH值为11.0时，最大吸收峰红移了16 nm，出现在450 nm附近.这一变化可能与碱性条件下吡咯烷上N的脱质子化有关 [ 20 20 ] .因此，可以初步推断探针Daepna的荧光性质在不同的pH值条件下也将发生改变，具有作为荧光探针的潜力. 荧光发射性能 2 继续研究了该探针在不同pH条件下的荧光响应.从 图 5 图 5 可以看出，该pH荧光探针的最大发射波长 λ max 为530 nm.同时可以看出，探针的荧光发射光谱与pH值的变化具有负相关性：随着pH值的不断降低，探针的荧光强度在持续地增强.这是由于探针在被质子化之前(pH 7.0~11.0)，其荧光较弱；而当体系的pH值逐渐降低(pH 6.0~2.0)，吡咯烷上的N被质子化，吡咯烷与骨架荧光基团(4-溴-1, 8-萘二甲酸酐)之间的光诱导电子转移(photoinduced electron transfer，PET)效应逐渐减弱 [ 21 21 ] ，使得荧光强度逐渐增强；当pH值为2.0时，体系的荧光强度为pH值11.0时荧光强度的10倍多.由此可见，该荧光探针在很宽的pH值范围(2.0~11.0)内均有较灵敏的响应. 而根据文献报道 [ 22 22 ] ，pH荧光探针通常分为两种：一种用于细胞质的pH检测，工作范围为pH 6.8~7.4；另一种用于酸性细胞器的pH检测，工作范围为pH 4.5~6.0.这些pH荧光探针在工作范围内都有着出色的荧光性能，但工作范围均较窄，只能应用于特定的工作环境.而本研究中的pH荧光探针Daepna则有着相对较宽的工作范围，既可以在偏中性的细胞质环境下工作，又可以在偏酸性的细胞器中工作，应用范围更加广泛. 荧光探针Daepna的荧光强度随pH值的变化还可以通过荧光可视化图( 图 6 图 6 )更加直观地观察.在365 nm紫外光照射下，pH值越低(酸性越强)的溶液发射的荧光越亮，且其荧光颜色为黄色，与其最大发射波长(530 nm)相对应.因此，该荧光探针有望应用于可视化、定性地检测目标溶液的pH值. 光稳定性 3 考虑到在复杂溶液体系中的应用，pH荧光探针通常要求具有较强的光稳定性.本研究对探针Daepna的光稳定性进行了探索.如 图 7 图 7 所示，该探针的荧光强度在30 min内始终维持恒定状态，说明它对pH值的响应十分迅速，且具有良好的光稳定性，不容易被光漂白，可用于长时间的检测. 抗干扰性 3 无论是自然水体中，还是生物体内，都存在着许多金属离子，这些金属离子的存在可能对pH值的检测造成干扰.为了排除这些金属离子的干扰，本文测试了在5种常见金属离子(Ca 2+ , Cu 2+ ，Fe 3+ , Mg 2+ , Zn 2+ )存在的条件下，该pH荧光探针的荧光强度变化.如 图 8 图 8 和 图 9 图 9 所示，虽然各金属离子的浓度(50 μ mol·L -1 )远远大于pH荧光探针Daepna的浓度(1 μ mol·L -1 )，但在酸性条件(pH 4.0)下，这5种金属离子对探针Daepna荧光强度的影响均在10%以内；在碱性条件(pH 8.0)下，这5种金属离子对探针Daepna荧光强度的影响均在20%以内. 上述结果表明，探针Daepna的荧光在酸性和弱碱性条件下均较稳定，即使在浓度高出很多倍的金属离子干扰下，也不影响对pH值的响应.这一性能使其在检测含有多种金属离子的细胞内pH值领域有潜在的应用. 结论 1 本文设计并合成了一种具有较宽的pH响应范围(2.0~11.0)的萘酰亚胺类荧光探针Daepna，通过核磁共振谱、质谱等手段对产物进行表征，确证了目标化合物的成功合成，并考察了它的紫外-可见光吸收和荧光发射性能. 本文方法以4-溴-1, 8-萘二甲酸酐为骨架，利用两分子1-(2-氨乙基)吡咯烷作为亲核试剂，能够实现荧光探针Daepna的一锅法合成，简化了合成过程.而且，由于Daepna分子两端都含有吡咯烷基团，故两个吡咯烷基团上的N都可以与H + 结合而被质子化，理论上具有比只有一个可以质子化位点的探针更高的灵敏度.实验结果证明：所合成的pH荧光探针Daepna在较宽的pH范围(2.0~11.0)内均有着较灵敏的响应，可用于多种工作环境；在30 min内表现出很好的光稳定性，不易被光漂白；在几种常见金属离子干扰下的荧光强度波动范围均小于20%，抗金属离子干扰能力强，可以适应复杂的离子环境.另外，该pH荧光探针还可以在紫外灯的照射下直接用于pH的可视化检测.鉴于这些优良性能，该pH荧光探针有望应用于细胞内pH值的检测. 参考文献 HOU J T, REN W X, LI K, et al. 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