基于会稽山古香榧林和新香榧林土壤环境的香榧籽品质分析

基于会稽山古香榧林和新香榧林土壤环境的香榧籽品质分析 Analysis of Torreya grandis Seeds Quality Based on Soil Environment Survey of Ancient and New Torreya grandis Forests in Kuaiji Mountain 1 first-author 孙小红，女，副教授，现从事药用植物资源可持续利用研究。E-mail: xhsun2000@163.com 孙小红，女，副教授，现从事药用植物资源可持续利用研究。E-mail: xhsun2000@163.com xhsun2000@163.com 1 1 1 1 corresp E-mail: 301053841@qq.com E-mail: 301053841@qq.com 301053841@qq.com 绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴 312000 绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴 312000 Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, Zhejiang,China Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, Zhejiang,China 研究了浙江绍兴会稽山区两处古香榧林（约千年）和一处新香榧林（25年）的土壤环境，并对两种香榧林土壤微生物群落进行比较，探讨了古香榧林和新香榧林土壤环境与产出香榧籽品质的关系。结果显示，有机质平均含量最高的为来自诸暨市的古香榧林（11.39%），是新香榧林的3倍以上；新香榧林的土壤全氮、全磷、水解氮、速效钾和有效磷含量均显著低于古香榧林；新香榧林土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和蛋白酶活性也均显著低于古香榧林；新香榧林土壤细菌多样性（~3.77）低于古香榧林土壤，而真菌多样性（~3.9）高于古香榧林土壤；新香榧林所产香榧籽果形偏圆，油脂及蛋白含量显著低于古香榧林香榧籽。相关性分析结果表明，香榧林土壤细菌多样性与其全氮、全磷、有机质以及各种土壤酶活性呈显著正相关；而其真菌多样性与土壤有机质、脲酶和蔗糖酶之间呈显著负相关；其有机质含量与香榧籽种形指数、油脂和蛋白质含量呈显著正相关。与新香榧林相比,古香榧林土壤肥力足,微生物群落多样性丰富。 The aim of this study is to explore the correlation between the qualities of Torreya grandis cv. ‘Merrillii’ seeds ( T. grandis seeds) and soil Environment by analyzing the properties of T. grandis seeds and comparing the enzyme activities, nutrients and microbial communities of soils within Kuaiji Mountain ancient (~1 000 a) and new (25 a) T. grandis cv. ‘Merrillii’ forests. The results show that the highest average organic matter content is 11.39% in T. grandis forest from Zhuji. It is more than three times as much as that of new T. grandis forest. The contents of soil total nitrogen, total phosphorus, hydrolyze nitrogen, available potassium and effective phosphorus in the soil from new T. grandis forest are significantly lower than those from the ancient T. grandis forest. Soil urease, soil sucrase, phosphatase and soil protease activity from new T. grandis forest are also significantly lower than those from the ancient. Furthermore, the microbial diversity index indicates that the bacterial diversity from new T. grandis forest（~3.77） is lower than those from ancient. However fungal diversity from new T. grandis forest (~3.9) is higher than those from ancient. The shape of T. grandis seeds from the new forest is round slightly. The contents of oil and protein are significantly lower than those of the ancient forest. Correlation analysis shows that the bacterial diversity is positively correlated with organic matter, total nitrogen, total phosphorus and soil enzyme. But fungal diversity is negatively correlated with organic matter, soil urease and soil sucrase. A positive correlation is observed between organic matter and shape index, oil and protein content. Compared with modern T. grandis forest, the soil of ancient T. grandis forest has more fertility with better microclimate environment． 香榧林 香榧籽 土壤环境 多样性 品质 Torreya grandis forest Torreya grandis seed soil environment diversity quality 0　 引 言 1 香榧（ Torreya grandis cv. ‘Merrillii’）属于红豆杉科榧属植物，为常绿高大乔木，是集材用、药用、果用、油用和观赏于一体的经济树种 [ 1 1 , 2 2 ] 。香榧从花芽分化到果实成熟历时约27个月，独特的生物学特性和生态习性导致香榧生长环境特异性较高 [ 3 3 ] 。土壤是香榧赖以生存和生长的必要立地条件，土壤环境是影响香榧籽产量和品质的主要因素之一 [ 4 4 , 5 5 ] ，主要包括土壤理化因子、养分、酶活性和微生物多样性 [ 6 6 ] 。土壤理化因子影响土壤的孔隙性、含水量、土壤养分以及土壤酶的种类和活性等 [ 7 7 ] ；而土壤酶活性与土壤肥力有关，其活性可作为衡量土壤肥力水平的指标 [ 8 8 ] ；土壤微生物的组成和功能则在维持土壤系统健康方面发挥着重要作用 [ 9 9 , 10 10 , 11 11 ] 。 近年来，香榧种植效益极高，以致浙江及其周边省份香榧种植发展迅速，形成了很多新香榧林。然而，人们对香榧生长适宜性认识仍十分有限，导致新香榧林产量低、品质差。另外榧农在生产中盲目施用化学肥料，造成土壤养分非正常积累和环境富营养化。与新香榧林物种多样性丧失、土壤肥力退化相比，古香榧林生态系统仍保持较高的生产能力，与土壤养分的自我平衡密切相关 [ 12 12 , 13 13 ] 。因此研究香榧林土壤养分，分析香榧品质，构建香榧栽培良好的生态环境对香榧籽生产及其产业可持续发展具有重要意义。绍兴会稽山是香榧籽生产的核心产区，其千年古香榧林在2013年被世界粮农组织认定为全球重要农业文化遗产保护试点。本研究收集了位于会稽山古香榧林保护区诸暨市和嵊州市的两处古香榧林土壤以及嵊州市的一处新香榧林土壤为实验样本，希望通过研究其土壤养分、土壤酶活性和土壤微生物多样性，并与香榧品质进行相关性分析，为新香榧林土壤生态管理和香榧品质改善提供科学依据。 1　 材料与方法 1 1.1　采样位点基本情况 2 采样位点的香榧土壤样地基本情况见 表1 表1 。诸暨市赵家镇西坑村和嵊州市长乐镇小昆村的两处古香榧林均具有约千年的香榧生产历史，古香榧树分布集中、植被丰富。嵊州市长乐镇坎一村为现代万亩无公害新香榧林基地，引种香榧25年，植被单一。 样地 采样地点 经纬度 海拔/m 形成时间/a A 浙江省诸暨市赵家镇西坑村古香榧林 N29°41′41.05″E120°30′53.46″ 600 ~1 000 B 浙江省嵊州市长乐镇小昆村古香榧林 N29°30′31.70″E120°32′43.82″ 645 ~1 000 C 浙江省嵊州市长乐镇坎一村新香榧林 N29°28′17.92″E120°35′47.36″ 65 25 1.2　样品的采集 2 土壤样品采集：每个香榧栽培区中，按S形5点取样混合法，在香榧树树冠滴水线下，采集0~20 cm 深的土壤样品，装入无菌袋带回实验室，除去土壤样品中杂物，如植物根系、石块等，分成一式3份，一份于4 ℃储存，一份于-20 ℃储存，一份于室温下风干后自然储存。 香榧样品采集：每个样地随机选取香榧树30~40株，在每株树的南面随机采摘10个充分成熟的坚果，置于干燥、通风处晾晒并时常翻动，待腐熟后剥去外部青皮，干燥至含水量小于8%时，于低温、干燥、密闭处保存。 1.3　实验方法 2 1.3.1　香榧土壤化学测定 3 土壤有机质的测定采用高温灼烧法；土壤全氮采用浓硫酸消解后，用凯氏定氮法测定；土壤水解氮采用碱解-扩散法测定；土壤有效磷用碳酸氢钠-钼锑抗比色法测定；全磷采用氢氧化钠碱熔-钼锑抗比色法测定；速效钾通过火焰原子吸收分光光度法测定。 1.3.2　香榧土壤酶的活性测定 3 蔗糖酶活性通过3, 5-二硝基水杨酸比色法测定，用1 g土壤在37 ℃下水解24 h产生的葡萄糖毫克数表示 [ 14 14 ] ；脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，以1 g土壤在37 ℃下水解24 h产生的氨氮毫克数表示 [ 15 15 ] ；土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以37 ℃下从1 g土壤24 h内释放苯酚的量来表示；蛋白酶活性通过比色法测定，以1 g土壤中甘氨酸的微克数表示 [ 16 16 ] 。 1.3.3　香榧土壤细菌的变性梯度凝胶电泳(DGGE) 3 用ZR Fecal DNA MiniPrep™ Kit试剂盒（Zymo Research公司，货号D6010）提取土壤细菌总DNA进行琼脂糖凝胶电泳的检测；细菌16S rDNA V3片段的扩增采用通用引物对R518/F341，扩增条件为94 ℃，预变性2 min，25个循环(98 ℃变性10 s，58 ℃退火 15 s，68 ℃延伸1 min)，然后94 ℃，预变性2 min，30个循环（98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸 30 s）。细菌基因组PCR扩增产物经QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒（Qiagen公司，货号28704）纯化，对PCR扩增产物进行电泳分离。使用40%~60%变性梯度凝胶，将PCR产物加入到10%的聚丙烯酰胺凝胶中，按以下条件电泳：电泳缓冲液1×TAE（Tris乙酸盐EDTA缓冲液），电泳温度60 ℃，电压100 V，电泳时间20 h。电泳结束后，用硝酸银快速银染，以凝胶图像分析系统观察每个样品的电泳条带，拍照后回收凝胶，连接pEasy-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并送TaKaRa公司测序，找出与目的片段相似度高的菌种 [ 17 17 , 18 18 ] 。 1.3.4　香榧真菌的变性梯度凝胶电泳 3 真菌18S rDNA扩增采用引物NS1/GC-Fungi。PCR反应体系、反应条件以及变性梯度凝胶电泳条件参照文献[ 19 19 ]。DGGE条带的切胶、回收和克隆方法见参考文献[ 20 20 ]，将筛选到的阳性克隆送至TaKaRa公司测序。将测序序列与GenBank中的序列进行比较，以找到与目标片段具有高度相似性的菌种 [ 21 21 ] 。 1.3.5　香榧籽品质测定 3 每个样品测定30个坚果（香榧籽），采用游标卡尺测量种子长度、直径，计算种子种形指数（长度/直径）。单果质量使用电子分析天平测定。将每份香榧籽干燥至恒重，去壳后将仁粉碎均匀用于测定其内在品质指标。脂肪含量通过常规索氏提取法测定。蛋白质含量通过硫酸消解后用凯氏定氮法测定。 1.3.6　数据统计分析 3 数据分析采用Excel 2010和SPSS 19.0统计软件，不同处理的差异显著性采用Duncan法进行多重比较，使用Quantity One软件进行DGGE条带数字分析以计算样品中可检测到的DGGE条带数量。根据条带的相对位置和相对强度计算香农-威纳指数（ H ）、丰富度（ S ）和均匀度指数（EH）来评价微生物的多样性 [ 17 17 ] 。采用Pearson相关系数分析土壤微生物多样性、土壤酶活性、土壤养分和香榧籽品质的相关性。 2　 结果与分析 1 2.1　土壤氮磷钾、有机质及土壤酶活性分析 2 3个香榧林土壤样地氮磷钾和有机质含量测试结果见 表2 表2 ，土壤酶活性见 表3 表3 。从 表2 表2 可以看出，古香榧林土壤中全氮、全磷、水解氮、有效磷和速效钾含量均较新香榧林高，且存在显著性差异，而且也比一些文献报道值高 [ 5 5 ] ，说明古香榧林土壤养分具有更强的自我维持能力。其中，位于诸暨市的古香榧林土壤有机质为11.39%，高出新香榧林3倍以上，可能由于两处古香榧林已经存续了约千年，生物量较大，归还的有机物料也较多。而新香榧林种植期仅25年，生物量相对较少，故其有机质积累明显低于古香榧林 [ 22 22 ] 。土壤酶参与土壤中有机质的分解和氮磷钾等物质的循环，酶活性能反映土壤代谢功能 [ 23 23 ] 。从 表3 表3 可以看出，新香榧林土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和蛋白酶活性均最低，与古香榧林相比，差异显著( p < 0.05)。说明古香榧林通过土壤酶可催化生成更丰富的植物营养物质，促进了土壤养分的转化。 注： 同列不同字母表示差异显著( p < 0.05) 样地 有机质/% 全氮/g·kg -1 全磷/g·kg -1 水解氮/mg·kg -1 速效钾/mg·kg -1 有效磷/mg·kg -1 A 11.39±0.55 a 2.45±0.00 a 2.30±0.9 a 42.51±1.41 a 899.23±2.01 a 596.89±12.52 a B 9.93±0.00 b 1.68±0.10 b 1.91±0.3 b 38.50±0.01 b 701.53±2.00 b 496.47±13.35 b C 3.36±0.16 c 1.58±0.25 c 1.12±0.4 c 27.73±1.45 c 625.38±7.60 c 277.20±16.01 c 注： 同列不同字母表示差异显著( p < 0.05) 样地 脲酶/mg·g -1 蔗糖酶/mg·g -1 ·d -1 磷酸酶/mg·g -1 ·d -1 土壤蛋白酶/mg·g -1 ·d -1 A 1.36±0.27 b 15.02±0.31 b 0.22±0.02 a 2.66± 0.08 a B 1.53±0.06 a 17.36±0.57 a 0.15±0.01 b 2.02±0.04 b C 1.16±0.09 c 5.37±0.66 c 0.12±0.03 b 1.10±0.04 c 2.2　土壤细菌群落PCR-DGGE分析 2 以细菌16S rDNA V3高变区序列的通用引物R518/F341对纯化的香榧林土壤样品的总DNA进行PCR扩增反应。不同土壤样品的细菌香农-威纳指数、丰富度和均匀度 [ 24 24 ] 结果见 表4 表4 。可以看出：新香榧林土壤样品细菌多样性以及丰富度均低于其他两个古香榧林，样地A土壤样品的细菌香农-威纳指数最高，约为4.63，其丰富度也最高，约为28；新香榧林的土壤真菌香农-威纳指数以及丰富度均高于古香榧林，香农-威纳指数约为3.9，丰富度约为16，香农-威纳指数最低的是样地B古香榧林土壤，指数约为3.01，真菌丰富度最低的也是样地B古香榧林土壤，仅约为9。总体而言，新香榧林土壤真菌香农-威纳指数，丰富度和均匀度均比古香榧林高。 注： 同列不同字母表示差异显著( p < 0.05) 2 样地 3 细菌多样性 3 真菌多样性 H EH S H EH S A 4.63±0.02 a 0.96±0.01 ab 28±0.91 a 3.21±0.01 b 0.97±0.08 a 10±0.32 b B 4.18±0.06 b 0.99±0.02 a 19±1.02 b 3.01±0.05 c 0.95±0.04 ab 9±0.54 b C 3.77±0.01 c 0.97±0.02 ab 15±0.63 c 3.90±0.03 a 0.97±0.06 a 16±0.60 a 图1 图1 所示为不同香榧林土壤样地中细菌和真菌的DGGE图谱。对图中电泳条带的数量和亮度进行数字化处理。 如 图1 图1 （a）所示，条带1和3在所有土壤样品中均出现，条带5、8、9、10仅在两处古香榧林土壤样品中出现，为优势菌。对细菌DGGE图谱中12条主要条带进行测序，找到与目标细菌片段相似度高的细菌菌株，结果见 表5 表5 。从 表5 表5 可以看出，测序列与数据库中序列的相似性在96%~100%之间，这些菌主要分布在芽孢杆菌属、弗兰克氏菌属、链嗜酸菌属、膨胀芽孢杆菌属等。其中4号条带属于人参土膨胀芽孢杆菌，为从人参土壤样品中分离获得的新菌株 [ 25 25 ] ；弗兰克氏菌为一类固氮菌，可以与非豆科木本植物共生；短小芽孢杆菌为分解无机磷的优势芽孢杆菌，与土壤有机质、总氮含量等呈正相关关系 [ 26 26 ] 。有研究发现植被退化，其小单孢菌和马杜拉放线菌所占比例下降 [ 27 27 ] 。这说明两个古香榧林的土壤经过约千年的积累，植被丰富，枯枝落叶、腐殖质层深厚，根系分泌物多，细菌多样性也较高；而新香榧林为新开垦土壤，且基本裸露，腐殖质积累少，其土壤有机质低，细菌多样性差，小单孢菌属、短小芽孢杆菌属和马杜拉放线菌等较少。 条带号 相似菌株 相似性/% 登录号 分类 1 Bacterium Ellin 6512 97 HM748660.1 未分类 2 Shimazuella sp. 98 LC149525.1 岛津氏菌属 3 Brevibacillus sp. 100 KP670236.1 短小芽孢杆菌属 4 Tumebacillus ginsengisoli 98 KX019818.1 人参土膨胀芽胞杆菌 5 Streptacidiphilus sp. 97 KP126307.1 链嗜酸菌属 6 Cryptosporangium sp. 97 LN876497.1 隐孢菌属 7 Frankia sp. 97 KX825919.1 弗兰克氏菌属 8 Micromonospora sp. 96 HM059782.1 小单孢菌属 9 Fodinicola sp. 99 EU232177.1 矿生菌属 10 Uncultured bacterium 99 KT819101.1 未培养细菌 11 Brevibacillus sp. 96 KP670236.1 短小芽孢杆菌属 12 Actinomadura sp. 97 LC061304.1 马杜拉放线菌属 如 图1 图1 (b)所示，条带1、2为所有土壤样品都存在。条带4、6、8、9和10为新香榧林土壤所特有条带。对DGGE图谱中10条主要条带进行测序，找到与目标真菌片段相似度高的真菌菌株，结果见 表6 表6 。从 表6 表6 可以看出，所有序列与数据库中18S rDNA序列的相似性在92%~99%之间。集孢粪盘菌属多存在于食草动物的粪便中，可能与新香榧林使用兔粪和羊粪等有机肥有关。新香榧林优势真菌中病原真菌数量较高，主要为青霉属、曲霉属和虫囊菌属，可能与新香榧林林地土壤肥力退化有关。 条带号 相似菌株 相似性/% 登录号 分类 1 Auricularia sp. 95 DQ234542.1 木耳属 2 Cryptococcus sp. 99 EF363152.1 隐球菌属 3 Trichosporon sp. 93 AB001767.2 毛孢子菌属 4 Vanrija humicola strain 99 JX268556.1 腐殖隐球菌菌株 5 Bullera sp. 99 AY313033.1 布勒酵母属 6 Penicillium sp. 98 JX268595.1 青霉菌属 7 Minutisphaera sp. 99 JX474866.1 小球形菌属 8 Saccobolus sp. 92 U53393.1 集孢粪盘菌属 9 Aspergillus sp. 99 EF060444.1 曲霉属 10 Laboulbeniales sp. 99 EF060444.1 虫囊菌属 2.3　香榧籽品质比较 2 对3个土壤样地香榧籽的品质进行分析，结果见 表7 表7 。由 表7 表7 可知，从核形指数看，古香榧林所产香榧籽偏长、直径小、体型较瘪，而新香榧林种子则短小而偏圆；新香榧林所产香榧籽油脂含量和蛋白质含量均显著低于古香榧林。按照目前林业行业标准 [ 28 28 ] ，香榧籽质量应大于1.45 g，油脂含量应不小于52%。新香榧林所产香榧油脂含量不达标，为49.32%。3种香榧籽的蛋白质含量与文献值（12.1~16.43 g/100 g） [ 29 29 ] 基本一致。另外，新香榧林所产香榧籽出仁率略低，但不存在统计学意义。 样地 种子长度/cm 种子直径/cm 种子质量/g 种仁质量/g 出仁率/% 核形指数 油脂含量/% 蛋白质含量/(g/100g) A 3.01±0.18 b 1.40±0.09 b 2.12±0.01 ab 1.46±0.05 b 68.87±1.23 a 2.15±0.11 b 54.90±1.04 b 14.92±0.38 a B 3.25±0.16 a 1.43±0.07 b 2.40±0.03 a 1.61±0.03 a 67.08±2.10 ab 2.27±0.02 a 59.53±2.52 a 14.85±0.02 ab C 3.00±0.22 b 1.52±0.09 a 2.21±0.10 ab 1.47±0.12 b 66.52±1.10 ab 1.97±0.08 b 49.32±2.37 c 13.67±0.04 c 2.4　土壤微生物特性与理化因子、酶活性及香榧籽品质的相关性 2 采用Pearson相关系数法 [ 30 30 ] 分析3个香榧林土壤样地的微生物香农-威纳指数和理化因子及土壤酶的相关性，结果表明土壤微生物多样性与土壤理化因子和酶之间存在一定的相关性： 1） 香榧林土壤中细菌多样性与4种土壤酶活性及理化性质之间均呈正相关；土壤有机质与细菌香农-威纳指数及丰富度呈显著正相关，香农-威纳指数分别为0.929（ p < 0.05）和1.000（ p < 0.01）；土壤蛋白酶活性、磷酸酶活性、全磷、全氮、水解氮、有效磷、速效钾与细菌香农-威纳指数及丰富度也呈显著正相关（ p < 0.05）。这是由于土壤有机质和土壤养分丰富，可为土壤微生物提供充足的碳源和氮源，保持较高的土壤微生物活性，而这些微生物又可以不断把土壤中潜在养分转化为速效养分，改善土壤中氮、磷、钾的供应，从而促进微生物的生长。 2） 香榧林土壤中的真菌香农-威纳指数及丰富度与土壤有机质、土壤理化因子和各种土壤酶总体上呈负相关；有机质、蔗糖酶、脲酶与真菌多样性呈显著负相关（ p < 0.05）；蔗糖酶与真菌的香农-威纳指数为-1（ p < 0.01），呈极显著负相关。这表明真菌的生理代谢产物可能抑制了脲酶和蔗糖酶活性。 本研究中发现新香榧林土壤有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾含量以及蔗糖酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶活性均显著低于古香榧林。这是因为新香榧林人为干扰较多、植被多样性低，导致地表枯落物少且分解缓慢，向土壤中输送的有机质少，抑制了香榧的生长。而古香榧林经过千年的积累，人类活动影响相对较小，林下植被丰富，积累了丰富的有机质，为香榧生长提供了充足的养分和适宜的根际微生态环境。这与前人研究结果基本一致，土层深厚肥沃、有机质含量丰富的土壤更能促进香榧植物生长 [ 6 6 ] 。 全氮、速效钾、磷酸酶，土壤蛋白酶、细菌多样性、细菌丰富度皆与香榧出仁率呈显著正相关，说明这些指标对香榧出仁率影响较大。有机质含量还影响香榧籽种形指数、油脂和蛋白质含量，同时与种子宽度呈显著负相关。蔗糖酶与种形指数、坚果油脂含量和蛋白质含量显著相关，其中脲酶与油脂含量相关性极显著，相关系数为1.000（ p < 0.01），说明这两个酶含量高低影响香榧油脂和蛋白质内在指标，同时影响香榧籽的大小。 3　 结 论 1 本文研究了会稽山两处古香榧林和一处新香榧林的土壤环境，对其土壤微生物群落进行比较分析，并探讨了古香榧林和新香榧林土壤环境与产出香榧籽品质的关系，得出结论如下：1) 古香榧林土壤有机质、全氮、全磷、水解氮、速效钾、有效磷以及各种土壤酶含量普遍高于新香榧林，表明古香榧林土层深厚肥沃、有机质含量丰富，有利于高品质香榧籽的可持续性生产；2) 古香榧林所产香榧油脂含量和蛋白质含量均显著高于新香榧林，且符合中华人民共和国林业行业标准，而新香榧林所产香榧油脂含量略低于规定的标准值；3) 古香榧林土壤细菌多样性均高于新香榧林土壤，而真菌多样性低于新香榧林土壤。新香榧林优势真菌中病原真菌数量较高，主要为青霉属、曲霉属和虫囊菌属。香榧林土壤有机质含量、细菌多样性、土壤酶活性与香榧出仁率、种子形状、油脂及蛋白质含量均呈正相关。 参考文献 SUN X H , MANTRI N , GE J , et al . 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