MGO-MI纳米复合材料对乏氧癌细胞的放化疗增敏作用

MGO-MI纳米复合材料对乏氧癌细胞的放化疗增敏作用 Chemoradiotherapy Sensitization of MGO-MI Nanocomposites for Hypoxic Cancer Cells 1 first-author 杨 翠，女，硕士生，现从事放疗计划剂量学方面的研究。E-mail：wuli.yangcui@whu.edu.cn 杨 翠，女，硕士生，现从事放疗计划剂量学方面的研究。E-mail：wuli.yangcui@whu.edu.cn wuli.yangcui@whu.edu.cn 2 2 3 3 复旦大学附属肿瘤医院 放射治疗中心，上海 200032 复旦大学附属肿瘤医院 放射治疗中心，上海 200032 Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China 武汉大学 物理科学与技术学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 物理科学与技术学院，湖北 武汉 430072 School of Physical and Technology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China School of Physical and Technology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China 武汉大学中南医院 肿瘤放化疗科，湖北 武汉 430071 武汉大学中南医院 肿瘤放化疗科，湖北 武汉 430071 Department of Radiation Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China Department of Radiation Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 利用甲硝唑（metronidazole，MI）作为缺氧响应成分，使用分步合成法，制备磁性氧化石墨烯-甲硝唑（magnetic graphene oxide-metronidazole, MGO-MI）纳米复合材料，运用透射电子显微镜（TEM）,动态光散射（DLS），X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶红外变换光谱（FT-IR）等技术对其进行表征，并将得到的MGO-MI纳米复合材料与两种非小细胞肺癌细胞（H1975和A549）共同培养，从生物细胞层面评估其毒性、缺氧敏感性以及放射增敏作用。结果显示，在常氧情况下，一定浓度（0~100 μg/mL）的MGO-MI纳米复合材料对两种细胞都没有表现出明显的毒性，但是缺氧情况下，MGO-MI 纳米复合材料的毒性显著提高；该纳米复合材料还能有效增强X射线对两种癌细胞的杀伤作用，显著提高放疗效果，可望用于临床乏氧癌细胞放化疗。 With metronidazole (MI) as a hypoxia-responsive component, a step-by-step synthesis method was used to prepare magnetic graphene oxide-metronidazole (MGO-MI) nanocomposites. Moreover, the characterizations of the nanocomposites were conducted using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). Subsequently, the obtained MGO-MI nanocomposites were co-cultured with two kinds of non-small cell lung cancer cells (H1975 and A549) to evaluate the cytotoxicity, hypoxia sensitivity and radiation enhancement effect of the nanocomposites at the biological cell level. The results show that under normoxia conditions, the cytotoxicity of the nanocomposites to both cells in a certain concentration range (0~100 μg/mL) is slight, while it is significantly increased under hypoxia conditions. In addition, the nanocomposites can also effectively enhance the suppression effect of X-ray on both cells， significantly improve the efficiency of radiation， and is expected to be used in clinical chemoradiotherapy of hypoxic cancer cells. MGO-MI纳米复合材料 缺氧敏感性 放射增敏 放化疗 MGO-MI nanocomposites hypoxia sensitivity radiation sensitization chemoradiotherapy 杨翠,熊锐,全红, 等.MGO-MI纳米复合材料对乏氧癌细胞的放化疗增敏作用[J].武汉大学学报（理学版）,2020,66(4):393-400. DOI:10.14188/j.1671-8836.2019.0044. 0　 引 言 1 近年来，癌症在我国的发病率持续增高，成为危害人类健康的重大疾病 [ 1 1 ， 2 2 ] 。但是由于肿瘤组织对X射线的吸收不高，使得目前临床上普遍需要较大剂量的放疗才能彻底地杀死肿瘤，而高剂量X射线又会对肿瘤周围的正常组织甚至危机器官造成伤害 [ 3 3 ] 。此外，化疗药物的非靶向运输也是造成全身毒性的重要原因，会带来极大的副作用 [ 4 4 ] 。加之目前实体瘤中普遍存在的缺氧现象，使得实体瘤内部普遍呈现药物和射线抗性，也使得对其的治愈更加困难 [ 5 5 ， 6 6 ] 。因此，人们迫切希望能够制造一种具有缺氧响应的载体，可以运载化疗药物或者放疗增敏剂进入肿瘤，以提高对乏氧细胞的抑制效果 [ 7 7 ， 8 8 ] 。 硝基咪唑类药物在缺氧的情况下可以经过一系列生物还原转化为氨基咪唑类药物 [ 9 9 ] ，并且转化后的氨基咪唑类药物不能通过自由扩散的方式逸出细胞 [ 10 10 ] ，因此药物在乏氧细胞内的浓度大大增加，提高了其对乏氧细胞生长的抑制效果。硝基咪唑类药物的这一特性吸引了大量的研究者，它被广泛地应用于缺氧响应载体的制造 [ 11 11 ] 和乏氧成像 [ 12 12 ] 的研究。另外，硝基咪唑类药物还被发现可以在放疗过程中模拟氧气的作用而促进放射自由基的产生，增强放疗的效果，因此也被广泛用作放疗增敏剂 [ 13 13 ， 14 14 ] 。但是，由于使用硝基咪唑类药物需要较高的用量才能达到较好的效果，而较高的药量又会造成较高的神经毒性，因此限制了其在临床上的应用 [ 15 15 ] 。 近年来，纳米技术的发展为生物材料的构建提供了很好的机遇 [ 3 3 ， 7 7 ， 9 9 ， 11 11 ， 16 16 ] 。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）作为石墨烯的衍生物，不仅具有极大的比表面积和良好的生物相容性，还拥有丰富的表面基团，使得GO更容易被修饰,因而成为理想的药物载体 [ 17 17 ] 。与此同时，研究发现，经过聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）的修饰，可以有效避免GO在高盐和高蛋白溶液中发生团聚 [ 18 18 ] ，能够更好地应用于生物载体的研制。 因此，本文利用GO作为药物载体，修饰PEG和甲硝唑（metronidazole，MI）使其在生物溶液中具有更好的水溶性，构建具有缺氧响应的纳米载体，再负载FePt磁性纳米粒子（magnetic nanopatticles, MNPs），合成磁性氧化石墨烯-甲硝唑（magnetic graphene oxide-metronidazole, MGO-MI）纳米复合材料，通过体外四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法和单细胞克隆形成实验，研究其对常氧和乏氧细胞的抑制效果以及放射增敏性。 1　 实验部分 1 1.1　试剂及仪器 2 试剂：乙酰丙酮铁（Fe(acac) 3 ，98%）、油酸（C 18 H 34 O 2 ，OA，分析纯）、油胺（C 18 H 37 N，OL，95%）购自美国Aladdin试剂有限公司；RPMI-1640培养液订购于美国HyClone公司；胎牛血清（FBS）、牛血清蛋白（BSA）、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液(10 000 IU/mL青霉素和10 000 μg/mL链霉素（100×）)订购于美国Sigma-Aldrich公司；氯铂酸（H 2 PtCl 6 ·6H 2 O，分析纯）购自上海试剂一厂；硼氢化钠（NaBH 4 ，96%）、无水乙醇（分析纯）、聚乙二醇2000（PEG 2000，保证试剂）购自中国国药集团；MI（C 6 H 9 N 3 O 3 ,保证试剂）购自上海生工生物工程股份有限公司；碳化二亚胺（EDC，99%）购自上海共价化学有限公司；二甲基氨基吡啶（DMAP，99%）购自上海天坛科技有限公司；GO溶液（5 mg/mL）购自苏州碳丰科技有限公司；MTT试剂购于上海源叶生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、多聚甲醛（4%）、结晶紫染色剂订购于中国Biosharp有限公司。 仪器：JEM-2010FEF型超高分辨率透射电子显微镜（UHR-TEM，JEOL公司）；Zetasizer Nano ZSP型动态光散射粒径分析仪（DLS particle size analyzer，Malvern公司）；ESCALAB250Xi 型X射线光电子能谱分析仪（XPS，Thermo Fisher公司）；Nicolet 6700型傅里叶红外变换光谱分析仪（FT-IR，Thermo Fisher公司）；细胞培养箱（Sanyo 公司）；MCO-170MUVL型三气培养箱（Panasonic公司）；VS-1300-U型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；CKX31型光学显微镜（Olympus公司）；160C型台式低速离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；Heraeus fresco 17型高速冷冻微量离心机（Thermo Fisher公司）；ModulusTMⅡ型酶标仪（Turner BioSystems公司）；Clinic-Unique型医用加速器（6 MV, Varian公司）。 1.2　样品制备 2 将500 mg PEG 2000，3.5 mmol EDC和3.15 mmol MI溶于100 mL的去离子水中，然后加入5 mL GO水溶液充分搅拌。随后，将7.0 mmol DMAP水溶液滴加至上述混合液中，室温下搅拌72 h，离心（8 000 r/min，5 min），收集，得到缺氧响应运载体，命名为GO-MI。 将0.386 mmol Fe(acac) 3 、1.5 mL油酸和1.5 mL油胺先后加入到100 mL无水乙醇中，电磁搅拌0.5 h；然后取20 mL 19.3 mmol/L H 2 PtCl 6 ·6H 2 O无水乙醇溶液加入到上述混合液中，继续搅拌0.5 h，缓慢滴加200 mL 65.7 mmol/L NaBH 4 乙醇溶液，40 °C持续搅拌2 h,离心（5 000 r/min，3 min）,收集，真空干燥箱（40 °C，10 h）干燥，得到FePt MNPs。 将得到的FePt MNPs（50 mg）和GO-MI缺氧响应运载体混合，室温超声6 h，离心（12 000 r/min， 10 min）,收集，真空干燥箱（40° C，10 h）干燥，得到MGO-MI 纳米复合材料。 1.3　样品表征 2 采用UHR-TEM观察MGO-MI 纳米复合材料的形貌和分散性；DLS检测样品的尺寸分布；XPS检测样品的表面化学成分组成；FT-IR检测样品的表面化学结构和化学键。 1.4　细胞培养与处理 2 人肺腺癌细胞（H1975）和腺癌人类肺泡上皮基底细胞（A549）均购于中国科学院细胞库，均使用含10%FBS的PRMI-1640完全培养基（含1%双抗），在细胞专用培养箱内孵育，培养环境为37 ℃，5%CO 2 。细胞使用磷酸盐（PBS）缓冲溶液进行清洗，使用胰蛋白酶进行消化，然后传代或铺板。细胞缺氧环境的培养条件为：三气培养箱，5%O 2 ，5%CO 2 ，90%N 2 。 1.5　照射条件 2 实验组细胞在室温下使用6 MV的医用X射线加速器照射，照射源至培养基上液面100 cm，上下各设置5 cm固体水作为建成区和背散射区，剂量率为400 cGy/s，光野面积为20 cm×20 cm。根据实验需要，选择不同剂量X射线（0、1、2、4、6、8和10 Gy）照射细胞后，将其置于培养箱培养。 1.6　MTT法检测细胞毒性 2 通过对两种非小细胞肺癌细胞（H1975和A549）在常氧和缺氧两种情况下的增殖抑制特性的检测，判断其缺氧响应特点以及MGO-MI对其的细胞毒性。首先，将分散好的细胞种植于2个96孔板，每孔100 μL，每孔细胞数约8 000个，在培养箱培养过夜使得细胞贴壁。然后，将浓度分别为0、4、10、20、30、40、50、80、160、200 μg/mL的MGO-MI 无血清培养基溶液加入细胞中，每孔100 μL（故实验浓度为配制浓度的一半），每种浓度溶液设置4个复孔和1个无细胞仅有药物的备底孔。最后，将2个细胞版分别置于细胞培养箱（常氧）和三气培养箱（缺氧）培养24 h，吸去上清，每孔加入100 μL无血清培养基稀释的0.5%MTT试剂，培养4 h，吸去上清后，每孔加入100 μL的DMSO溶解结晶，并用酶标仪于波长570 nm处读取吸光度。 <math display="block" id="M1"><mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mi mathvariant="normal">细</mi><mi mathvariant="normal">胞</mi><mi mathvariant="normal">存</mi><mi mathvariant="normal">活</mi><mi mathvariant="normal">率</mi><mo stretchy="false">（</mo><mi mathvariant="normal">c</mi><mi mathvariant="normal">e</mi><mi mathvariant="normal">l</mi><mi 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d形成肉眼可见的菌落。弃上清，使用PBS缓冲溶液冲洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，再使用PBS缓冲溶液冲洗2次，结晶紫染色30 min，然后计数克隆数（计数细胞大于50的克隆数）。 首先，根据（2）~(4)式计算平均接种率PE、克隆形成率CR和细胞存活分数SF： <math display="block" id="M2"><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi mathvariant="normal">未</mi><mi mathvariant="normal">照</mi><mi mathvariant="normal">射</mi><mi mathvariant="normal">细</mi><mi mathvariant="normal">胞</mi><mi mathvariant="normal">克</mi><mi mathvariant="normal">隆</mi><mi mathvariant="normal">数</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">未</mi><mi mathvariant="normal">照</mi><mi mathvariant="normal">射</mi><mi mathvariant="normal">细</mi><mi mathvariant="normal">胞</mi><mi mathvariant="normal">接</mi><mi mathvariant="normal">种</mi><mi mathvariant="normal">数</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn mathvariant="normal">100</mn><mi mathvariant="normal">%</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=3408251&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=3408250&type= 54.69466782 8.63599968 <math display="block" id="M3"><mi mathvariant="normal">C</mi><mi mathvariant="normal">R</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>x</mi><mo stretchy="false">)</mo><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>x</mi><mtext> </mtext><mi mathvariant="normal">G</mi><mi mathvariant="normal">y</mi><mi mathvariant="normal">照</mi><mi mathvariant="normal">射</mi><mi mathvariant="normal">剂</mi><mi mathvariant="normal">量</mi><mi mathvariant="normal">下</mi><mi mathvariant="normal">细</mi><mi mathvariant="normal">胞</mi><mi mathvariant="normal">克</mi><mi mathvariant="normal">隆</mi><mi mathvariant="normal">数</mi></mrow><mrow><mi>x</mi><mtext> </mtext><mi mathvariant="normal">G</mi><mi mathvariant="normal">y</mi><mi mathvariant="normal">照</mi><mi mathvariant="normal">射</mi><mi mathvariant="normal">剂</mi><mi mathvariant="normal">量</mi><mi mathvariant="normal">下</mi><mi mathvariant="normal">细</mi><mi 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http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=3408254&type= 21.75933456 8.38199997 其中，CR( x )和CR（0）分别指 x Gy和0 Gy照射剂量下的克隆形成率。实验重复3次以上，结果以“平均值±标准差”表示。 然后，根据多靶单击模型 <math display="block" id="M5"><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">F</mi><mo>=</mo><mn mathvariant="normal">1</mn><mo>-</mo><mo stretchy="false">（</mo><mn mathvariant="normal">1</mn><mo>-</mo><msup><mrow><mi mathvariant="normal">e</mi></mrow><mrow><mrow><mrow><mo>-</mo><mi>D</mi></mrow><mo>/</mo><mrow><msub><mrow><mi>D</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">0</mn></mrow></msub></mrow></mrow></mrow></msup><msup><mrow><mo stretchy="false">）</mo></mrow><mrow><mi>N</mi></mrow></msup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=3408257&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=3408256&type= 34.62866592 4.23333359 利用GraphPad Prism 软件拟合细胞存活曲线。其中， D 代表实验照射剂量， D 0 代表平均致死剂量， N 代表靶点数。 D 0 越小（或 N 越大）代表细胞对X射线越敏感；反之， D 0 越大（或 N 越小）代表细胞对X射线越不敏感。 D 0 和 N 都是衡量细胞对X射线放射敏感性的重要参数。 最后，计算SF为0.9时，MGO-MI的剂量增强因子（dose enhancement factor，DEF）： <math display="block" id="M6"><mi mathvariant="normal">D</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">F</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi mathvariant="normal">C</mi><mi mathvariant="normal">o</mi><mi mathvariant="normal">n</mi><mi mathvariant="normal">t</mi><mi mathvariant="normal">r</mi><mi mathvariant="normal">o</mi><mi mathvariant="normal">l</mi><mi mathvariant="normal">组</mi><mi mathvariant="normal">产</mi><mi mathvariant="normal">生</mi><mi mathvariant="normal">的</mi><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">F</mi><mi mathvariant="normal">为</mi><mn mathvariant="normal">0.9</mn><mi mathvariant="normal">时</mi><mi mathvariant="normal">X</mi><mi mathvariant="normal">射</mi><mi mathvariant="normal">线</mi><mi mathvariant="normal">的</mi><mi mathvariant="normal">剂</mi><mi mathvariant="normal">量</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">M</mi><mi 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纳米复合材料样品的形貌、分散性和尺寸，如 图1 图1 所示。由 图1 图1 （a）可以看到，GO为片层结构，仅有单原子的厚度，且能在二维平面上无限延展，因此有很强的负载潜力，是一种理想的药物运载体；FePt MNPs呈球形，尺寸接近3 nm，随机地分散于GO上，且颗粒分明，说明FePt MNPs分散性很好且能够在GO表面大量负载。由 图1 图1 （b）可得，MGO-MI 纳米复合材料在水溶液中的平均尺寸为245.3 nm。聚合物分散性指数(polymer dispersity index, PDI)是常用的描述聚合物平均分子量大小的参数。PDI越大，说明样品的分子量分布越宽；PDI越小，说明样品分子量分布越均匀。由 图1 图1 （b)所示数据可计算得到，样品的PDI为0.248，说明样品的分子量分布比较均匀。 2.1.2　XPS图 3 由于TEM不能观察到MI这样的小分子，因此不能确定MI是否成功修饰在GO表面，故利用XPS检测GO、GO-MI和MGO-MI的表面化学元素组成，以进一步确定MI和FePt MNPs 在GO表面的负载情况，如 图2 图2 所示。在GO的能谱上只检测到C和O两种元素，但是经过MI修饰之后，在结合能399.46 eV处检测到了N元素的峰，其来源于MI分子上的硝基（—NO 2 ），意味着MI成功修饰于GO的表面。另外，在MGO-MI的谱图上，检测到Fe和Pt元素的峰，再一次证明了FePt MNPs在GO上成功负载。 2.1.3　FT-IR光谱 3 利用FT-IR光谱检测GO、GO-MI和MGO-MI的表面化学键的变化，以进一步确定MI和FePt MNPs的负载方式，结果如 图3 图3 所示。 由 图3 图3 可知： 1） 在GO的光谱上检测到了位于3 425，1 629和871 cm -1 处的分别代表羟基（—OH）、碳碳双键(C=C)和环氧基团(C—O—C)的伸缩振动的吸收峰，还有1 720 cm -1 和1 214 cm -1 两处共同代表羧基（—COOH）伸缩振动的吸收峰 [ 18 18 ， 19 19 ] （1 214 cm -1 处的峰值代表C原子和羟基—OH之间的键的振动造成的峰，是羧基峰的一个组成部分），充分证明了GO表面含有丰富的含氧官能团，利于进一步表面修饰和药物负载。 2） 经过MI的修饰，在GO-MI的光谱上出现了位于1 564和1 380 cm -1 处代表—NO 2 的伸缩振动的吸收峰，并且1 720 cm -1 处代表—COOH的吸收峰消失了，说明MI的负载与GO表面的—COOH有关，证明在EDC和DMAP的作用下，MI分子上的—OH与GO表面的—COOH脱水酯化，共价连接到GO表面。 3） 在MGO-MI的光谱上再次检测到位于1 706 cm -1 处代表—COOH的吸收峰，这个吸收峰是由FePt MNPs 上油酸分子内的—COOH产生的，证明了FePt MNPs的成功负载。另外，在MGO-MI的光谱上，由于金属元素的存在，对硝基的吸收峰出现干扰，发生了峰位的移动和覆盖 [ 7 7 ] ，只能检测到位于1 564 cm -1 处代表—NO 2 的伸缩振动的吸收峰。此外，没有其他明显的吸收峰的消失，意味着FePt MNPs可能是通过静电吸附作用附着在GO表面 [ 19 19 , 20 20 ] 。 2.2　细胞毒性和缺氧敏感性 2 图4 图4 为利用MTT比色法得到的MGO-MI对H1975和A549细胞分别在常氧（normoxia）和缺氧(hypoxia)状态下的细胞毒性检测结果。从 图4 图4 （a）和4（b）可以看出，MGO-MI样品在常氧条件下，对于两种细胞都没有明显的毒性，即使在MGO-MI 浓度为100 μg/mL的情况下，两种细胞的存活率也依然在0.85以上，说明MGO-MI本身对细胞的毒性不高，具有很好的生物相容性。然而，在缺氧情况下，MGO-MI对两种细胞的毒性都明显增强，其浓度为2 μg/mL时对于H1975细胞的抑制效果就已经近似等于常氧情况下浓度为100 μg/mL时的抑制效果。对于A549细胞，毒性的增强情况与H1975细胞类似。也就是说，相较于常氧情况，样品在缺氧的情况下细胞毒性有将近50倍提升，证明了MGO-MI的缺氧敏感性。 样品在缺氧情况下的毒性增强与缺氧响应载体中MI的作用有关。如引言部分所述，MI上的硝基在缺氧情况下会通过一系列的生物还原转化为氨基，转化之后的MI将不能通过自由扩散的方式逸出细胞 [ 9 9 ， 10 10 ] 。这也就直接导致药物在细胞内浓度的提高，进而使得药物的作用增强，说明这种缺氧响应载体确实可以显著提高药物对乏氧细胞的抑制作用。 2.3　放射增敏 2 2.3.1　SF柱形图分析 3 图5 图5 为通过单细胞克隆形成实验得到的10 μg/mL MGO-MI 纳米复合材料对H1975和A549细胞放射增敏作用的实验结果。 图5 图5 （a）和5（b）分别为两种细胞的SF柱形图，从图中可以看到： 1） 在没有添加MGO-MI（Control组）的情况下，随着X射线照射剂量的升高，H1975细胞的SF变化很大，在4 Gy的情况下，SF就降到了0.2以下，而A549细胞在8 Gy的情况下才达到了类似的效果，说明不同细胞对X射线有不同的敏感性。这种细胞间放射敏感性的差异主要与细胞本身应对Ｘ射线的机制有关。因为X射线主要通过对细胞的DNA造成单链或双链的断裂导致细胞的死亡 [ 18 18 ] 。研究发现，细胞内部普遍存在对DNA单链断裂的修复机制 [ 21 21 ] ，而这种修复能力的不同也是导致X射线杀伤效率存在细胞差异性的原因，在临床上表现为不同组织对X射线的辐射耐受性不同。 2） 在无照射（0 Gy）情况下，经过10 μg/mL MGO-MI处理，H1975细胞的SF为0.92，A549细胞的SF为0.84，说明MGO-MI对两种细胞的克隆能力都有一定的影响，表现出药物毒性。 3） 在X射线和MGO-MI共同作用（MGO-MI组）的情况下，两种细胞都表现出更低的SF。为了说明SF的降低不单单是MGO-MI毒性作用的结果，还与MGO-MI对X射线杀伤效果的提升能力有关,以2 Gy下的细胞存活分数（SF 2 ）为例进行详细说明。由 图5 图5 (a)可知，对于H1975细胞，MGO-MI的毒性作用结果表现为:0 Gy照射情况下其SF为0.92；在2 Gy照射情况下，Control组的SF 2 为0.62, 因此，如果单纯是MGO-MI的毒性作用，那么MGO-MI组的SF 2 应为0.62×0.92=0.57。但是由 图5 图5 （a）可知，实验组的SF 2 为0.46，明显低于单纯毒性作用下的结果, A549细胞的实验结果与H1975细胞实验结果类似，故可以说明MGO-MI 纳米复合材料的确能够提升X射线的杀伤效果。 这种放射增敏效果与MGO-MI上的FePt MNPs和MI有关。一般，放疗过程可以分为物理、化学和生物3个过程 [ 3 3 ] 。在X射线穿过人体的过程中，X射线会与物质进行相互作用产生次级电子 [ 3 3 ] ，而次级电子会继续电离水分子产生放射性自由基来释放能量，此过程被称为物理过程。随后，放射性自由基会氧化DNA骨架以使DNA单链或者双链断裂，此过程被称为化学过程。DNA单链断裂是可以修复的，被称为亚致死损伤，而双链断裂是不能修复的，被称为致死性损伤，此过程被称为生物过程。因此，没有经过修复的DNA会导致细胞无法无限克隆增殖而死亡 [ 21 21 ] ，这是放疗杀死肿瘤的原理。在FePt MNPs中含有高原子序数（High-Z）元素Pt，这种High-Z元素对射线具有较高的吸收系数 [ 22 22 ] ，可以通过增强X射线与物质相互作用中的光电效应提高射线能量的沉积，产生更多的次级电子。另外，研究发现，MI在放疗过程中可以模拟氧气的作用而增加自由基的产生 [ 23 23 ] 。故FePt MNPs和MI的存在可以导致更高的X射线能量沉积和更多的放射性自由基产生，这样就能造成更多的DNA损伤，因而提高了X射线的杀伤效果。 2.3.2　细胞存活曲线分析 3 图5 图5 （c）和5（d）是利用多靶单击模型拟合的H1975和A549细胞的存活曲线。在放射生物学中，细胞存活曲线越弯曲代表细胞对射线越敏感。 从 图5 图5 （c）和5（d）中可以看到： 1） 在未添加MGO-MI（Control组）的情况下，H1975细胞的存活曲线比A549细胞的更弯曲，进一步证明了H1975细胞对X射线更敏感。 2） 在MGO-MI组，对于H1975细胞，可以看到在MGO-MI的作用下，曲线更加弯曲，说明MGO-MI可以提高H1975细胞的放射敏感性；对于A549细胞，这种效果不明显。实验表明，MGO-MI对细胞敏感性的影响还依赖于细胞本身的性质，其中更深层的作用机制还需要进一步通过细胞分子生物实验来探究。 2.3.3　DEF分析 3 为了量化MGO-MI对细胞的放射增敏作用效果，利用（6）式计算SF为0.90时MGO-MI的DEF。10 μg/mL MGO-MI对H1975细胞的DEF为1.28，对A549细胞的DEF为1.21。也就是说在达到相同放疗效果的情况下，应用MGO-MI处理肿瘤细胞可以在一定程度上降低其所需要的处方剂量，同时也就能明显地降低肿瘤周围正常组织和危机器官接受到的剂量，即能够在保证肿瘤控制率的情况下大大降低正常组织产生并发症的概率。这说明MGO-MI是一种很有潜力的放疗增敏剂，有望应用于未来的临床研究。 3　 结 语 1 通过分步合成法制备出具有缺氧响应的多功能MGO-MI纳米复合材料。用MTT和单细胞克隆形成实验评估了其对常氧和乏氧癌细胞的毒性、缺氧敏感性以及放射增敏效果。结果表明，该复合材料在常氧情况下对细胞的毒性不强，具有良好的生物相容性；在缺氧情况下，其毒性有近50倍的提升，能够大大提高药物对于乏氧细胞的抑制作用。另外，在放射增敏方面，MGO-MI纳米复合材料一方面可以明显提高X射线对H1975和A549的杀伤效果；另一方面经过MGO-MI处理后的H1975细胞表现出对X射线更强的敏感性。并且，对于H1975和A549细胞，10 μg/mL MGO-MI的DEF分别为1.28和1.21，总体上看，10 μg/mL MGO-MI对X射线的剂量有1.2倍的提升，能够大大提高放疗的作用效果。因此，MGO-MI纳米复合材料可以作为一种潜在的临床乏氧细胞的放化疗增敏剂。 虽然实验结果令人鼓舞，但是仍然存在一些研究上的局限： 1） 本文只涉及一种缺氧情况，这对说明其缺氧敏感性是不充分的，故还需要进一步补充其他条件下的缺氧实验； 2） 在放射增敏性研究方面只做了单一浓度（10 μg/mL）纳米粒子的多剂量克隆形成实验，需要进一步比较其他浓度下实验的放疗效果，以找出最佳的临床应用浓度； 3） 文中的研究只是涉及到体外细胞实验，需要进行体内动物实验以及细胞分子生物实验，以进一步确定MGO-MI 纳米复合材料在体内的毒性、放射增敏效果和其内在作用机制。 参考文献 FAN W , SHEN B , BU W B , et al . A smart upconversion-based mesoporous silica nanotheranostic system for synergetic chemo-/radio-/photodynamic therapy and simultaneous MR/UCL imaging [J]. Biomaterials , 2014 , 35 ( 32 ): 8992 - 9002 . DOI: 10.1016/j.biomaterials.2014.07.024 http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.07.024 . A smart upconversion-based mesoporous silica nanotheranostic system for synergetic chemo-/radio-/photodynamic therapy and simultaneous MR/UCL imaging BOURAS A , KALUZOVA M , HADJIPANAYIS C G . Radiosensitivity enhancement of radioresistant glioblastoma by epidermal growth factor receptor antibody-conjugated iron-oxide nanoparticles [J]. Journal of Neuro Oncology , 2015 , 124 ( 1 ): 13 - 22 . DOI: 10.1007/s11060-015-1807-0 http://dx.doi.org/10.1007/s11060-015-1807-0 . Radiosensitivity enhancement of radioresistant glioblastoma by epidermal growth factor receptor antibody-conjugated iron-oxide nanoparticles SONG G S , CHENG L , CHAO Y , et al . Emerging nanotechnology and advanced materials for cancer radiation therapy [J]. Advanced Materials ， 2017 : 1700996-1-1700996 - 26 . DOI: 10.1002/adma.201700996 http://dx.doi.org/10.1002/adma.201700996 . Emerging nanotechnology and advanced materials for cancer radiation therapy BAO Z R , HE Y M , QUAN H , et al . FePt nanoparticles: A novel nanoprobe for enhanced HeLa cells sensitivity to chemoradiotherapy [J]. RSC Advances , 2016 , 6 ( 41 ): 35124 - 35134 . DOI: 10.1039/C6RA03990A http://dx.doi.org/10.1039/C6RA03990A . FePt nanoparticles: A novel nanoprobe for enhanced HeLa cells sensitivity to chemoradiotherapy RAMALHO T C , ALENCASTRO R B , LA-SCALEA M A , et al . Theoretical evaluation of adiabatic and vertical electron affinity of some radiosensitizers in solution using FEP, ab initio and DFT methods [J]. Biophysical Chemistry , 2004 , 110 ( 3 ): 267 - 279 . DOI: 10.1016/j.bpc.2004.03.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.bpc.2004.03.002 . Theoretical evaluation of adiabatic and vertical electron affinity of some radiosensitizers in solution using FEP, ab initio and DFT methods MOULDER J E , ROCKWELL S . Tumor hypoxia: Its impact on cancer therapy [J]. Cancer and Metastasis Reviews , 1987 , 5 ( 4 ): 313 - 341 . DOI: 10.1007/BF00055376 http://dx.doi.org/10.1007/BF00055376 . Tumor hypoxia: Its impact on cancer therapy SUN Y M , MIAO H T , MA S J , et al . FePt-Cys nanoparticles induce ROS-dependent cell toxicity, and enhance chemo-radiation sensitivity of NSCLC cells in vivo and in vitro [J]. Cancer Letters , 2018 , 418 , 27 - 40 . DOI: 10.1016/j.canlet.2018.01.024 http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2018.01.024 . FePt-Cys nanoparticles induce ROS-dependent cell toxicity, and enhance chemo-radiation sensitivity of NSCLC cells invivo and in vitro BERNIER J . Current state-of-the-art for concurrent chemoradiation [J]. Seminars in Radiation Oncology , 2009 , 19 ( 1 ): 3 - 10 . DOI: 10.1016/j.semradonc.2008.09.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.semradonc.2008.09.002 . Current state-of-the-art for concurrent chemoradiation LIU H M , ZHANG Y F , XIE Y D , et al . Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy [J]. International Journal of Nanomedicine , 2017 , 12 : 1065 - 1083 . DOI: 10.2147/ijn.s125286 http://dx.doi.org/10.2147/ijn.s125286 . Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy PREKEGES J L , RASEY J S , GRUNBAUM Z , et al . Reduction of fluoromisonidazole, a new image agent for hypoxia [J]. Biochemical Pharmacology , 1991 , 42 ( 12 )： 2387 - 2395 . Reduction of fluoromisonidazole, a new image agent for hypoxia LIU H M , XIE Y D , ZHANG Y F , et al . Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma [J]. Biomaterials , 2017 , 121 ( 121 ): 130 - 143 . DOI: 10.1016/j.biomaterials.2017.01.001 http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.01.001 . Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma YIP C , BLOWER P J , GOH V , et al . Molecular imaging of hypoxia in non-small-cell lung cancer [J]. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular , 2015 , 42 ( 6 ): 956 - 976 . DOI: 10.1007/s00259-015-3009-6 http://dx.doi.org/10.1007/s00259-015-3009-6 . Molecular imaging of hypoxia in non-small-cell lung cancer TANZER K , FEKETEOV L , PUSHCHNIGG B , et al . Reactions in nitroimidazole triggered by low-energy (0⁃2 eV) electrons: Methylation at N1-H completely blocks reactivity [J]. Angewandte Chemie , 2014 , 53 ( 45 ): 12240 - 12243 . DOI: 10.1002/anie.201407452 http://dx.doi.org/10.1002/anie.201407452 . Reactions in nitroimidazole triggered by low-energy (0⁃2 eV) electrons: Methylation at N1-H completely blocks reactivity ÈAVÈIÆ J , TURÈIÆ J , MARTINAC P , et al . Metronidazole in the treatment of chronic radiation proctitis: Clinical trial [J]. Croatian Medical Journal , 2000 , 41 ( 3 ): 314 - 318 . DOI: 10.1001/archfami.9.9.933 http://dx.doi.org/10.1001/archfami.9.9.933 . Metronidazole in the treatment of chronic radiation proctitis: Clinical trial URTASUN R , BAND P , CHAPMAN J D , et al . Radiation and high-dose metronidazole in supratentorial glioblastomas [J]. New England Journal of Medicine , 1976 , 294 ( 25 ): 1364 - 1367 . DOI: 10.1056/nejm197606172942503 http://dx.doi.org/10.1056/nejm197606172942503 . Radiation and high-dose metronidazole in supratentorial glioblastomas SHAO J D , XIE H H , HUANG H , et al . Biodegradable black phosphorus-based nanospheres for in vivo photothermal cancer therapy [J]. Nature Communications , 2016 , 7 : 12967 . DOI: 10.1038/ncomms12967 http://dx.doi.org/10.1038/ncomms12967 . Biodegradable black phosphorus-based nanospheres for in vivo photothermal cancer therapy FANF M , WANG K G , LU H B , et al . Covalent polymer functionalization of graphene nanosheets and mechanical properties of composites [J]. Journal of Materials Chemistry , 2009 , 19 ( 38 ): 7098 - 7105 . DOI: 10.1039/B908220D http://dx.doi.org/10.1039/B908220D . Covalent polymer functionalization of graphene nanosheets and mechanical properties of composites SUN X M , LIU Z , WELSHER K , et al . Nano-graphene oxide for cellular imaging and drug delivery [J]. Nano Research , 2008 , 1 ( 3 ): 203 - 212 . DOI: 10.1007/s12274-008-8021-8 http://dx.doi.org/10.1007/s12274-008-8021-8 . Nano-graphene oxide for cellular imaging and drug delivery TAO Y , JU E G , REN J S , et al . Immunostimulatory oligonucleotides-loaded cationic graphene oxide with photothermally enhanced immunogenicity for photothermal/immune cancer therapy [J]. Biomaterials , 2014 , 35 ( 37 ): 9963 - 9971 . DOI: 10.1016/j.biomaterials.2014.08.036 http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.08.036 . Immunostimulatory oligonucleotides-loaded cationic graphene oxide with photothermally enhanced immunogenicity for photothermal/immune cancer therapy GUO S J , SUN S H . FePt nanoparticles assembled on graphene as enhanced catalyst for oxygen reduction reaction [J]. Journal of the American Chemical Society , 2012 , 134 ( 5 ): 2492 - 2495 . DOI: /10.1021/ja2104334 http://dx.doi.org//10.1021/ja2104334 . FePt nanoparticles assembled on graphene as enhanced catalyst for oxygen reduction reaction TAKAHASHI A , KUBO M , MA H Y , et al . Nonhomologous end-joining repair plays a more important role than homologous recombination repair in defining radiosensitivity after exposure to high-LET radiation [J]. Radiation Research 2014 , 182 ( 3 ): 338 - 344 . DOI: 10.1667/RR13782.1 http://dx.doi.org/10.1667/RR13782.1 . Nonhomologous end-joining repair plays a more important role than homologous recombination repair in defining radiosensitivity after exposure to high-LET radiation HAO Y , ALTUNDAL Y , MOREAU M , et al . Potential for enhancing external beam radiotherapy for lung cancer using high-Z nanoparticles administered via inhalation [J]. Physics in Medicine and Biology , 2015 , 60 ( 18 ): 7035 - 7043 . DOI: 10.1088/0031-9155/60/18/7035 http://dx.doi.org/10.1088/0031-9155/60/18/7035 . Potential for enhancing external beam radiotherapy for lung cancer using high-Z nanoparticles administered via inhalation FEKETEOVA L , ALBRIGHT A L , SORENSEN B S , et al . Formation of radical anions of radiosensitizers and related model compounds via electrospray ionization [J]. International Journal of Mass Spectrometry , 2014 , 365 ⁃ 366 ： 56 - 63 . DOI: 10.1016/j.ijms.2013.12.014 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.014 . Formation of radical anions of radiosensitizers and related model compounds via electrospray ionization 10.14188/j.1671-8836.2019.0044 TB383 Q81 A 1671-8836（2020）04-0393-08 YANG Cui,XIONG Rui,QUAN Hong, et al .Chemoradiotherapy Sensitization of MGO-MI Nanocomposites for Hypoxic Cancer Cells [J]. J Wuhan Univ （ Nat Sci Ed ）,2020,66(4):393-400. DOI: 10.14188/j.1671-8836.2019.0044 http://dx.doi.org/10.14188/j.1671-8836.2019.0044 (Ch). YANG Cui,XIONG Rui,QUAN Hong,et al.Chemoradiotherapy Sensitization of MGO-MI Nanocomposites for Hypoxic Cancer Cells [J].J Wuhan Univ （Nat Sci Ed）,2020,66(4):393-400. DOI:10.14188/j.1671-8836.2019.0044(Ch). 杨翠,熊锐,全红, 等.MGO-MI纳米复合材料对乏氧癌细胞的放化疗增敏作用[J].武汉大学学报（理学版）,2020,66(4):393-400. DOI:10.14188/j.1671-8836.2019.0044 杨翠,熊锐,全红, 等.MGO-MI纳米复合材料对乏氧癌细胞的放化疗增敏作用[J].武汉大学学报（理学版）,2020,66(4):393-400. DOI:10.14188/j.1671-8836.2019.0044 2019-03-20 2020-08-24 2020-11-28 武汉大学学报（理学版） 4 66