初始pH值对菌株UR-2诱导Cd(Ⅱ)碳酸盐成矿的影响

初始pH值对菌株UR-2诱导Cd(Ⅱ)碳酸盐成矿的影响 Effect of Initial pH Value on Induction of Cd(Ⅱ) Carbonate Mineralization by Strain UR-2 first-author 王继勇，男，副教授，现从事土壤重金属污染修复。E-mail：wangjiyong66@sina.com 王继勇，男，副教授，现从事土壤重金属污染修复。E-mail： wangjiyong66@sina.com wangjiyong66@sina.com 武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070 武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070 School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Science, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei, China School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Science, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei, China 碳酸盐矿化微生物通过可诱导碳酸盐成矿来固化重金属Cd 2+ 。为了探究pH条件对此过程的影响，选取碳酸盐矿化菌株UR-2，制备了不同初始pH条件(pH 5.0~10.0)下该菌株诱导Cd 2+ 成矿的产物。结果表明，菌株生长的最佳初始pH值为8.0左右，对0.2 g/L Cd 2+ 的固化率达到70.5%。X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)分析结果显示，产物为碳酸镉(CdCO 3 )。pH值的变化对菌株Cd 2+ 的络合能力以及矿化产物的形貌、组成均有较大影响。 Carbonate mineralized microorganisms solidify heavy metal Cd 2+ ions by inducing carbonate mineralization. In order to explore the effect of pH conditions on this process, the carbonate mineralization strain UR-2 was selected to produce the product of Cd 2+ ion-induced mineralization under different initial pH conditions (pH 5.0-10.0). The results show that the optimum initial pH value for strain growth is about 8.0, and the solidification rate for 0.2 g/L Cd 2+ ion is 70.5%. X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscopy (SEM) analysis show that the product is cadmium carbonate (CdCO 3 ); with the change of pH value, the strain has great influence on the complexation ability of Cd 2+ and the morphology and composition of mineralized products. 碳酸盐矿化菌株 碳酸镉 pH值 carbonate mineralization bacteria cadmium carbonate pH value 引言 1 镉(cadmium, Cd)是具有很强致癌作用的重金属元素 [ 1 1 , 2 2 ] 。我国部分水体和土壤存在严重的镉污染问题，近年来由于稻田土壤镉含量超标引发的“镉米”问题，已经直接威胁到了我国的食品安全 [ 3 3 ~ 5 5 3~5 ] 。 产脲酶的碳酸盐矿化微生物可以有效固化土壤和水体中游离态的重金属Cd 2+ ，进而修复污染的土壤和水体 [ 6 6 , 7 7 ] 。许燕波等 [ 8 8 ] 从重金属污染土壤中筛选出的产脲酶碳酸盐矿化菌对镉污染土壤中有效态镉的去除量达到0.31 mg/kg；Kang等 [ 9 9 ] 筛选的产脲酶菌株对溶液中镉的去除率达85.4%；Lin等 [ 10 10 ] 采用产脲酶微生物对污染土壤进行修复后，污染土壤产出的糙米中镉含量降低了31.2%；Li等 [ 11 11 ] 分离得到的产脲酶芽孢杆菌对溶液中Cd 2+ 去除率为98%。这是由于产脲酶微生物分泌的脲酶可水解尿素，使细菌周围的CO 3 2- 含量增加，进而诱导溶液中的Cd 2+ 与CO 3 2- 结合，形成碳酸晶体，最终以菌体为晶核形成碳酸镉(CdCO 3 )沉淀 [ 12 12 ] 。碳酸镉是一种不耐酸的重金属碳酸盐，因此, pH值是影响Cd 2+ 碳酸盐成矿的重要因素。同时，pH值对微生物分泌可催化尿素水解的脲酶活性也有很大影响。目前，对碳酸盐矿化菌的研究多以筛选高修复性能的菌株为主，初始pH值对矿化产物影响的研究则较少。 本文选用从红棕壤中筛选分离出的一株高效产脲酶菌株UR-2，考察了初始pH值对该菌株诱导生成CdCO 3 微观形貌的影响，以期为利用产脲酶菌治理含镉废水与镉污染土壤提供技术支持。 材料及方法 1 材料及仪器 2 实验菌株：碳酸盐矿化菌株UR-2为本实验室从红棕壤中分离得到。 产脲酶菌株生长培养基(选择性培养基)：蛋白胨1 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，尿素2 g/L，葡萄糖0.1 g/L，pH 7.0。 LB培养基：酵母浸出粉5 g/L，氯化钠5 g/L，蛋白胨1 g/L。 仪器：A360型紫外-可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；IL-500型哈希浊度仪(上海肯强仪器有限公司)；pH10S-E型笔式酸度计(上海精密仪器仪表有限公司)；DDS-320型精密电导率仪(上海精密仪器仪表有限公司)；JSM-IT300型场发射扫描电子显微镜系统(SEM，日本电子株式会社)；D8 Adwance型多功能X射线衍射仪(XRD，布鲁克AXS公司)；Nicolet6-700型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR, Thermo电子科学仪器公司)等。 菌株培养与检测 2 将40 mL产脲酶菌株生长培养基加入到50 mL锥形瓶中，121 ℃条件下灭菌30 min后冷却。从保存产脲酶菌株的LB培养基斜面上挑取部分菌苔，接种到灭菌后的培养液中，置于恒温摇床(150 r/min，37 ℃)中培养。测量培养液的光密度值OD 600 nm 以及培养液的浊度、pH值和电导率。其中，OD 600 nm 值表征细菌生长的状况。 培养液中尿素含量的检测采用二甲氨基苯甲醛显色分光光度法 [ 13 13 ] 。由于溶液中同时存在CO 3 2- 和HCO 3 - 离子，使用滴定法不便检测CO 3 2- 增加的含量，故选用苯酚钠-次氯酸钠比色法 [ 14 14 , 15 15 ] 检测培养液中氨氮含量变化，以确定菌株所产脲酶的活性变化。 细菌诱导矿化实验设计 2 从保存产脲酶菌株的LB培养基斜面上挑取部分菌苔，接种到150 mL灭菌后的产脲酶菌株生长培养基中，补加CdCl 2 溶液，使培养液中Cd 2+ 含量为0.2 g/L。用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液将培养液最终pH值分别调至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0.将灭菌好的6瓶培养液于37 ℃、150 r/min恒温摇床培养。每12 h检测一次培养液中Cd 2+ 含量和OD 600 nm 值。其中，Cd 2+ 含量检测采用高连斌等 [ 16 16 ] 的检测方法。 同时设置不添加Cd 2+ 的4瓶培养液作为对照，培养液培养温度设置为37 ℃。接种培养48 h后，将培养液最终pH值分别调整为6.0，7.0，8.0，9.0，最终Cd 2+ 含量调整为0.2 g/L，同样条件继续培养12 h。结束后，将两组溶液过滤，截留的矿化产物用蒸馏水洗涤3次，置于干燥箱中60 ℃干燥12 h备用。 矿化产物的分析 2 采用扫描电子显微镜系统观察矿化产物的微观形貌；采用X射线衍射仪分析矿化产物的晶相；采用红外光谱仪(KBr压片)在4 000~400 cm -1 范围内分析矿化产物的红外光谱。 结果与分析 1 矿化细菌的生长特性 2 产脲酶菌株UR-2的生长曲线及其培养液的各项参数变化见 图 1A 图 1A ~ 1D 1D 。 A:生长曲线; B:尿素和氨氮含量; C: pH值; D:电导率 A: growth curves; B:content of urea and ammonia nitrogen; C: pH value; D: conductivity 由 图 1A 图 1A 可见，菌株UR-2的生长曲线符合微生物生长的“S”形曲线。培养0~8 h为菌株生长的迟缓期，细菌生长缓慢；培养8~20 h是菌株生长的对数期，细菌生长速率达到最大；培养20~40 h菌株生长进入稳定期，此时，培养液的浊度达到最大值，菌株代谢产物逐渐积累；培养40 h以后，菌株生长进入衰退期，此时，培养液的浊度开始下降。 由 图 1B 图 1B 可见，培养液的氨氮(NH 3 -N)和尿素含量变化与菌株生长密切相关。在菌株UR-2生长的迟缓期两参数变化幅度均较小；在对数期，随着培养液中脲酶含量的迅速上升，尿素迅速水解，NH 3 -N含量迅速增加；稳定期培养液中尿素分解完全，尿素水解率达到94.5%，代谢产物NH 3 -N含量达到最大值0.81 g/L；进入菌株生长的衰退期后，培养液中NH 3 -N含量下降，可能是由于部分NH 4 + 离子以氨气(NH 3 )的形式挥发到空气中所致。 由 图 1C 图 1C 和 图 1D 图 1D 可见，培养液的pH值和电导率的变化趋势基本相同，菌株在生长的对数期分泌大量脲酶，使尿素迅速水解，同时急剧提高了培养液的pH值和电导率；在菌株生长的稳定期，培养液的pH值和电导率达到最大，其中pH最大值为9.15；进入菌株生长的衰退期后，由于NH 3 和CO 2 挥发，菌液的pH和电导率有所下降。 上述各参数的变化表明，菌株UR-2是一株高效产脲酶菌株，可迅速提高其生长环境的pH值。同类研究中，王瑞兴等 [ 6 6 ] 选用的产脲酶芽孢杆菌对尿素的水解率为80%；许燕波等 [ 8 8 ] 选用的碳酸盐矿化菌对尿素的水解率为67.5%。而本研究菌株UR-2对尿素的水解率高达94.5%，明显优于上述研究选用的碳酸盐矿化菌。UR-2菌株的这一特性，有利于诱导溶液中金属阳离子的碳酸盐成矿。 pH值对矿化细菌生长代谢的影响 2 培养液的初始pH值是影响微生物生长代谢的重要因素，直接影响代谢产物CO 3 2- 的最终含量和培养液最终的pH值，决定菌株对Cd 2+ 的固化能力。不同初始pH值对菌株UR-2生长及代谢的影响见 图 2 图 2 。 由 图 2A 图 2A 和 图 2B 图 2B 可知，在弱酸性(pH 6.0)培养条件下，菌株UR-2的生长较缓慢，菌株生长进入对数期的时间较晚，稳定期培养液最终的OD 600 nm 较低，NH 3 -N含量仅达到0.2 g/L；在中性和偏碱性培养条件下，菌株生长良好，培养液OD 600 nm 较高，NH 3 -N含量在pH值为8.0、9.0的条件下最大，最大值为0.92 g/L；在较强碱性(pH 10.0)培养条件下，菌株UR-2几乎不生长。这一实验结果表明，菌株UR-2更能适应碱性环境。该菌株可能是一株产酸菌，酸性条件下代谢产物的积累会抑制菌株的进一步生长繁殖。在pH值为5.0和10.0的条件下，菌株UR-2难以生长，可能是较强酸性或碱性条件下，菌株的生长受到了抑制。因此，在探究pH值对细菌矿化产物的影响时，培养液初始pH值设置为6.0，7.0，8.0，9.0。 不同pH条件下矿化细菌固化Cd 2+ 的进程 2 不同培养pH值条件下，菌株UR-2培养液中固化Cd 2+ 的进程见 图 3 图 3 。由 图 3A 图 3A 和 图 3B 图 3B 可见，培养液中Cd 2+ 含量的变化与细菌的生长代谢密切相关。在pH 5.0的培养液中，菌株生长受到明显抑制，OD 600 nm 值较低，菌株生长缓慢。在pH 10.0的培养液中，Cd 2+ 直接与OH - 发生固化反应，菌株难以生长，最终OD 600 nm 值较低，与 图 2 图 2 结果一致。 在pH为6.0~9.0的培养液中，前8 h，Cd 2+ 含量基本不变，菌株快速繁殖，但由于脲酶活性较低，代谢产物CO 3 2- 的浓度较低，因而Cd 2+ 的固化率较低；8~36 h阶段，由于脲酶活性提高，尿素水解量逐渐增大，培养液中NH 4 + 与CO 3 2- 增加，当CO 3 2- 浓度达到一定量时，培养液中游离态Cd 2+ 的含量迅速减少；36~72 h阶段，随着营养物质的消耗和代谢产物的积累，细菌开始衰亡，同时由于尿素基本水解完全，Cd 2+ 的固化率逐渐趋于稳定。 在pH 6.0~9.0范围内，菌株UR-2对Cd 2+ 的固化率随着pH值的增加而提高，pH 8.0时，固化率在72 h达到70.5%，显示该菌株对镉污染水体具有修复治理的潜能。 矿化产物表征 2 XRD分析 3 在添加Cd 2+ 与未添加Cd 2+ 的比较中，未添加Cd 2+ 组培养后产物为菌悬液，因此下列讨论的矿化产物为添加Cd 2+ 组在pH值为6.0~9.0下制备。 CdCO 3 的标准卡片(JCPDS 85-0989) [ 17 17 ] 中，特征峰为2 θ =23.8°、32.1°和50.1°，三者分别对应(002)、(100)和(101)晶面。在不同pH值条件下，矿化产物的XRD图谱见 图 4 图 4 。由 图 4 图 4 可见，随pH值升高，矿化产物的CdCO 3 结晶性和组分有较大改变。初始pH值为6.0时，矿化产物的特征峰并不明显，表明矿化产物在酸性条件下结晶度较差；初始pH值为7.0，8.0，9.0条件下，矿化产物的特征峰较为尖锐，此条件下成矿产物结晶性较好；初始pH值为9.0时，在36.7°和48.9°处出现了Cd(OH) 2 的特征峰，表明碱性条件下在CdCO 3 沉淀中掺杂了Cd(OH) 2 晶体。由XRD图谱可知，pH条件对菌株UR-2诱导Cd 2+ 形成CdCO 3 的过程有较大影响，矿化产物CdCO 3 在酸性条件下结晶性较差，在碱性条件下则较易形成，纯度也较高，而在较强碱性条件下，成矿产物中可能会掺杂Cd(OH) 2 晶体。 SEM分析 3 由于CdCO 3 不耐酸，因此培养液的pH条件对成矿产物的形貌和粒径的影响会更加明显。分别对不同pH培养条件下所得矿化产物在扫描电子显微镜(SEM)下进行扫描，所得微观形貌见 图 5 图 5 。 A:bacterial suspension without Cd 2+ ; B: pH 6.0;C: pH 7.0;D: pH 8.0;E: pH 9.0 由 图 5 图 5 可见，未添加Cd 2+ 的对照组中主要以细菌悬浮为主，未形成矿化产物( 图 5A 图 5A )。在添加Cd 2+ 组别中，不同pH培养条件下，矿化产物均以椭球状颗粒包裹在细菌菌体表面，椭球形颗粒的粒径和相互间团聚程度随pH值的升高逐渐增大，证明Cd 2+ 是该实验形成矿化产物的主要原因，且无杂质离子干扰。 添加Cd 2+ 组所形成的矿化产物中，初始pH值为6.0时产物球形颗粒的粒径多在50~100 nm范围内( 图 5B 图 5B )；pH值为7.0时，粒径增大到100 nm左右( 图 5C 图 5C )；pH值上升到8.0后，菌体细胞表面的球形颗粒明显是多个小球体“抱团”聚合形成，粒径较小的CdCO 3 颗粒基本消失，菌株细胞表面出现了粒径100~200 nm的椭球型颗粒( 图 5D 图 5D )；当pH值为9.0时，矿化产物团聚现象更为明显，微观结构已看不到分散的小粒径颗粒，菌株表面粒径较大的椭球形颗粒粒径已达300 nm左右( 图 5E 图 5E )。碱性条件下出现的球形颗粒团聚现象，可能是由于溶液中形成了Cd(OH) 2 晶体，其在CdCO 3 颗粒间形成了连接作用，从而导致了团聚现象，且随pH值的增高，溶液中Cd(OH) 2 晶体含量增多，从而使CdCO 3 颗粒进一步团聚为大颗粒。 上述结果表明，菌株UR-2诱导Cd 2+ 形成矿化产物的形貌受pH值影响显著：随着培养液的pH值从酸性上升到碱性，细菌表面形成的椭球形矿化产物粒径逐渐增大，碱性条件下出现团聚现象。同时，从SEM图可推导菌株UR-2诱导Cd 2+ 成矿的过程：菌株产生的脲酶水解尿素形成的CO 3 2- 与溶液中的Cd 2+ 形成椭球形CdCO 3 晶体，晶体间互相结合形成颗粒，颗粒间团聚并包裹细菌。 FT-IR光谱分析 3 微生物的细胞壁或细胞膜都会吸附一定量的重金属离子。为了探究菌株UR-2对Cd 2+ 是否存在吸附作用，分别对不同pH条件下生成的矿化产物进行FT-IR光谱( 图 6 图 6 )分析。 图 6 图 6 中的主要吸收峰见 表 1 表 1 。 波数范围/cm -1 吸收峰 2 478~3 683 主要为所含水的O—H的伸展振动，蛋白质碳骨架的C—H键、氨基的N—H键的伸缩振动 1 640~1 650 蛋白质酰胺Ⅰ带上的C—O伸缩振动 1 530~1 545 蛋白质酰胺Ⅱ带上的氨基N—H弯曲振动与C—N伸展振动的叠加 1 450~1 462 P—O和C—S的伸缩振动以及C—O与O—H伸缩振动的叠加 1 410~1 420 C—O键伸缩振动和O—H面内弯曲振动 1 020~1 032 磷酸基团—PO 4 3- 、胺基C—N的伸缩振动和环状糖碳骨架的振动；CO 3 2- 的对称伸缩振动 560~580 金属原子与氧原子Cd—O和O—Cd—O基团的振动 由 表 1 表 1 可知，细菌细胞壁吸附Cd 2+ 后，细胞壁上的磷酸盐、羧基等基团与Cd 2+ 形成了络合物，共存于细菌菌体表面的CdCO 3 颗粒中。 图 6 图 6 进一步印证了矿化产物的形成是由菌株产生CO 3 2- 与Cd 2+ 形成的包覆晶体。pH值从6.0上升到9.0的过程中，矿化产物在1 417 cm -1 和1 446 cm -1 附近的吸收峰逐渐增强。这一实验现象可能是由于碱性条件下细胞壁上的—OH与Cd 2+ 络合能力增强所引起的。随着pH值的增大，1 540 cm -1 处的吸收峰逐渐减弱，可能是—NH与Cd 2+ 的络合能力减弱所致。由FT-IR光谱分析的结果可知，环境pH值对细菌细胞壁吸附络合Cd 2+ 的能力也有很大影响。 通过FT-IR光谱和SEM图的分析可确定菌株UR-2固化Cd 2+ 的机理：在矿化菌株UR-2诱导Cd 2+ 成矿过程中，细菌细胞壁吸附Cd 2+ 等阳离子作为有效结晶位点，与CO 3 2- 形成CdCO 3 晶体，逐渐包裹细菌菌体，最终形成沉淀。 结论 1 本研究通过探究不同初始pH值(pH 5.0~10.0)培养条件下碳酸盐矿化菌株UR-2的生长状况及其诱导Cd 2+ 成矿的能力，得到结论如下：1)菌株UR-2生长过程中可分泌脲酶水解培养液中的尿素，使培养液中CO 3 2- 含量和pH值均升高，诱导溶液中Cd 2+ 形成碳酸盐晶体；2) XRD检测结果显示，pH值对矿化产物CdCO 3 的结晶度和组成均有较大影响；SEM扫描结果证明，随pH值的增大，细菌表面形成的CdCO 3 颗粒粒径增大，对细菌的包裹程度提高；由FT-IR光谱可知，pH值对细菌细胞壁部分基团络合吸附Cd 2+ 的能力有较大影响；3)矿化菌株UR-2的细胞壁能络合吸附Cd 2+ ，并以这些Cd 2+ 作为有效结晶位点与CO 3 2- 形成CdCO 3 晶体，进一步形成沉淀，未添加Cd 2+ 的菌悬液无沉淀产生。 综上所述，菌株UR-2对Cd 2+ 固化效果较好，特别是在偏碱性环境下。本研究表明菌株UR-2在治理含镉废水与镉污染土壤方面具有一定的潜在应用价值。 参考文献 吴婧, 董欣敏, 郑燕芳, 等.镉致癌的分子机制研究进展[J].生态毒理学报, 2015, 10 (6):54-61. 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