2型糖尿病血清Afamin蛋白组学研究

2型糖尿病血清Afamin蛋白组学研究 Proteomics Research of Serum Afamin in Type 2 Diabetes first-author 冯里茹，主管技师，现从事血清蛋白质学研究。 E-mail：jqryy@163.com 冯里茹，主管技师，现从事血清蛋白质学研究。 E-mail：jqryy@163.com jqryy@163.com corresp E-mail： junwangwh@hotmail.com E-mail： junwangwh@hotmail.com junwangwh@hotmail.com 深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020 深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020 Shenzhen Center for Chronic Disease Control，Shenzhen 518020，Guangdong， China Shenzhen Center for Chronic Disease Control，Shenzhen 518020，Guangdong， China Afamin是与2型糖尿病（T2DM）密切相关的糖蛋白，本研究主要利用免疫印迹（Western Blot）和酶联免疫（ELISA）的方法研究T2DM血清Afamin的变化趋势，并进一步利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）方法以及免疫印迹的方法探讨并验证T2DM病人血清中Afamin糖基化修饰状态的变化。结果显示，T2DM病人Afamin条带灰度较健康对照显著增强（ p =0.010 1），血清Afamin在T2DM组和健康对照组浓度分别6.03±0.19 μg/mL和5.07±2.12 μg/mL，且两组之间具有显著性差异（ p =0.001 9）；在Afamin高甘露糖型糖基化修饰异质性分析中，原血清以及Con A洗脱蛋白质中均检测到Afamin，而流穿蛋白质中未检测到Afamin，即所有血清Afamin都存在高甘露糖型糖链；iTRAQ标记定量数据显示血清高甘露糖型Afamin在T2DM中发生显著性上调，Western Blot结果验证了这一变化趋势（ p =0.046 2）。 Afamin is a sort of glycoprotein closely related to type 2 diabetes (T2DM). Western Blot and ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） were used to analyze the changing trend of serum Afamin from T2DM, iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification） was applied to explore the glycosylation modified state of serum Afamin from T2DM, and Western Blot was adopted to validate this data. The results showed that Afamin appeared up-regulated significantly in T2DM ( p =0.010 1). The average content of serum Afamin was 6.03 ± 0.19 μg/mL in T2DM, which was 5.07±2.12 μg/mL in the health control ( p =0.001 9). In high mannose heterogeneity analysis, we could see Afamin developing bands in crude serum and serum proteins eluted from Con A. However, we could not see Afamin band in the flow through. The results indicated that all of serum Afamin had high mannose glycan. The results of iTRAQ showed high mannose type Afamin was up-regulated in T2DM and Western Blot validated this data ( p =0.046 2). 2型糖尿病 糖基化 高甘露糖型 Afamin type 2 diabetes glycosylation high mannose type Afamin 0　 引 言 1 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是一种由于胰岛素作用异常导致糖、脂代谢紊乱，以慢性高血糖为特征的一组代谢性疾病 ［ 1 1 ］ ，调查数据显示，2014年全球有3.78亿T2DM患者，预计到2035年，T2DM患者将达到6亿 ［ 2 2 ］ ，而且预计有1/3甚至1/2的糖尿病患者未被诊断 ［ 3 3 ］ 。2018年我国糖尿病患病率是12.8% ［ 4 4 ］ ，其中90%~95%是T2DM。T2DM严重威胁人类的生活质量甚至是生命安全，已经成为重大的公共卫生问题。 Afamin是白蛋白基因家族的成员 ［ 5 5 ］ ，主要在肝脏中表达，通过分泌进入血浆，也存在于脑脊液、卵泡等生物体液 ［ 6 6 ］ 。流行病学调查显示，血清Afamin与胰岛素抵抗密切相关 ［ 7 7 ］ ，与T2DM高危因子如高血压发生率、腰围增加、高密度脂蛋白下调、甘油三酯上调和葡萄糖浓度增加等显著正相关 ［ 8 8 ］ ；Afamin浓度每增加10 mg/L，T2DM患病风险增至原来的1.19倍 ［ 9 9 ］ 。另外，Afamin还可协助维持Wnt蛋白的活性 ［ 10 10 ］ ，而Wnt蛋白会引发线粒体的氧化应激，导致胰岛素抵抗、促进脂肪的合成进而增加T2DM的易感性 ［ 11 11 ~ 14 14 11~14 ］ 。因此，Afamin与糖尿病的发生发展密切相关。但也有研究表明，Afamin可以促进葡萄糖的代谢吸收 ［ 15 15 ］ ，且具有特异性转运α和γ维生素E（维生素E最重要的两种形式）的功能 ［ 5 5 ， 6 6 ， 15 15 ， 16 16 ］ ，而维生素E可通过清除自由基、减少过氧化脂质形成来缓解氧化应激 ［ 17 17 ］ 。因此，Afamin与糖尿病的相关性有待进一步研究。 糖基化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，糖基化修饰与糖尿病的发生和发展密切相关，Afamin是一种有15%糖含量的87 ×10 3 糖蛋白，存在5个预测的糖基化修饰位点，90%以上的Afamin上存在2~6和2~3唾液酸双触角结构 ［ 6 6 ］ ，但目前血清Afamin糖基化修饰研究较少 ［ 6 6 ， 18 18 ］ ，基于Afamin糖基化分析其与糖尿病相关性的研究尚未见报道。 本研究通过免疫印迹和酶联免疫的方法研究T2DM血清Afamin的变化趋势，并进一步利用同位素标记相对和绝对定量方法（isobaric tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ）和免疫印迹的方法探讨并验证T2DM病人血清中Afamin糖基化修饰状态的变化。 1　 材料与方法 1 1.1　样品收集 2 本实验血清样本来源于深圳市公共卫生防治项目“生物标志物在糖尿病预防控制中的推广应用”。采用2014年美国糖尿病学会指定的T2DM诊断标准 ［ 19 19 ］ ，随机选取健康对照26例，T2DM病人46例，T2DM组纳入标准为：血压正常，无其他器质性病变，随机血糖值≥11.1 mmol/L且伴有糖尿病典型症状、FPG（空腹血糖）值≥7.0 mmol/L（有糖尿病症状或者无糖尿病症状但两天FPG值 ≥7.0 mmol/L）、OGTT（2 h）值≥11.1 mmol/L（有糖尿病症状或者无糖尿病症状两天OGTT（2 h）值≥11.1 mmol/L）；健康对照纳入标准为：血压正常，无其他器质性病变，FPG值 < 5.6 mmol/L。本研究通过本中心伦理委员会审批，所有受试者均签署知情同意书。 1.2　仪器、试剂及材料 2 仪器：1100型高效液相系统（Agilent公司），Triple TOF TM 5600型高效液相质谱联用系统（LC-MS/MS，AB SCIEX公司），Mini-PROTEAN @ Tetra System型电泳仪（Bio-Rad公司），GS-800型凝胶成像系统（Bio-Rad公司），Chemidoc MP型化学发光成像系统（Bio-Rad公司），Multiskan GO型全波长酶标仪（Thermo Scientific公司），SPD1010型真空离心浓缩仪（Thermo Scientific公司）。 试剂与材料：蛋白G（Protein G）琼脂糖填料（5 mL，生化级，GE Health公司），伴刀豆凝集素填料Con A（5 mL， 生化级，Sigma公司），碘代乙酰胺（5 g，生化级，Sigma公司），二硫苏糖醇 （5 g，电泳级，Bio-Rad公司），十二烷基硫酸钠（SDS，100 g，电泳级，Bio-Rad公司），胰蛋白酶（100 μg，质谱级，Promega公司），iTRAQ标记试剂（八标，质谱级，AB SCIEX公司），ECL化学发光剂（200 mL，电泳级，Bio-Rad公司）、Afamin抗体（100 μL，电泳级，Abcam公司），HRP（辣根过氧化物酶）标记抗山羊IgG抗体（100 μL，生化级，爱必信公司），一抗稀释液（100 mL，生化级，碧云天公司），4×蛋白电泳上样缓冲液（10 mL， 电泳级，Bio-Rad公司）。Afamin酶联免疫试剂盒（96孔，USCN公司）；实验用水为Milli-Q纯水仪纯化去离子水。 1.3　实验方法 2 1.3.1　血清中Afamin及高甘露糖型Afamin的相对定量分析 3 1.3.1.1 样品制备 4 1） 血清Afamin样品。选取T2DM组和健康对照（CON）样本各3例（男/女比例为1∶2，年龄介于45~60岁之间），血清用去离子水稀释10倍，考马斯亮蓝法测定血清总蛋白质浓度 ［ 20 20 ］ ，根据蛋白质浓度确定上样量和体积。加入4×上样缓冲液，样品含50 μg蛋白质。沸水浴5 min，使蛋白变性，短时离心，取上清一式两份上样。 2） 高甘露糖型Afamin样品。凝集素富集已经广泛应用于富集糖蛋白 ［ 21 21 ， 22 22 ］ ，根据Con A可特异性识别高甘露糖的特性 ［ 22 22 ~ 24 24 22~24 ］ ，使用Con A富集血清中的高甘露糖型糖蛋白。伴刀豆凝集素Con A Sepharose TM 4B装入离心旋转柱，等量T2DM组和CON组血清蛋白质样本使用结合缓冲液 （20 mmol/L Tris-HCl/0.5 mol/L NaCl/1 mmol/L MnCl 2 /1 mmol/L CaCl 2 ）。稀释后经0.45 μm滤膜过滤，处理后血清样本加至已经平衡好的Con A亲和柱，4 ℃摇匀过夜，离心（1 000 g ）收集流穿液，10倍样本体积结合缓冲液冲洗柱子5次并回收冲洗柱子 结合缓冲液，与流穿液（the flow through）合并，使用10倍样本体积0.3 mol/L 甲基- α - D -吡喃葡萄糖苷（methyl- α - D -glucopyranoside）/20 mmol/L Tris-HCl /0.5 mol/L NaCl （pH 7.4） 冲洗柱子5次，洗脱与Con A结合糖蛋白质，收集洗脱蛋白质（the eluate），3×10 3 超滤管浓缩流穿蛋白样品以及洗脱蛋白样品至等体积。 1.3.1.2 Western Blot分析 4 用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质样品，并将蛋白质转印至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜，5%（ m/V ）脱脂牛奶封闭，加入抗Afamin抗体后，置于冰箱4 ℃保鲜层孵育过夜，然后加入HRP标记的二抗孵育，最后，加入ELC显影液进行显色，利用化学发光成像系统进行显影，利用相对灰度值表示对应蛋白质含量。其中，在分析血清Afamin在T2DM人群中变化趋势时，蛋白质样品一式两份上样，其中1份已分离血清样本考马斯亮蓝染色作为上样参照。 1.3.2　血清中Afamin绝对定量分析 3 选取T2DM组病人46例，健康对照组26例。T2DM、健康对照纳入标准参考样品收集。血清样品稀释800倍后采用酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法测定Afamin的浓度。 1.3.3　血清Afamin蛋白高甘露糖型糖基化异质性分析 3 用Con A富集血清高甘露糖型糖蛋白（方法参考1.3.1.1节中Con A富集血清高甘露型糖蛋白），原血清、流穿蛋白质样品及洗脱蛋白质样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离转印至PVDF膜并用脱脂牛奶封闭。抗Afamin抗体4 ℃孵育过夜后加入HRP标记的二抗孵育。最后，加入ELC显影液显色，利用化学发光成像系统进行显影和灰度统计。 1.3.4　高甘露糖型Afamin蛋白的定量分析 3 同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ）方法利用多种同位素试剂标记蛋白质多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术 ［ 25 25 ， 26 26 ］ 。iTRAQ实验中，iTRAQ试剂包括三部分，报告基团、平衡基团和肽反应基团。报告基团和平衡基团搭配，保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比，肽反应基团能与肽段N端及赖氨酸（K）侧链氨基发生共价连接使肽段连上标记。 1） 样品制备。6例T2DM组血清样品，3例合成一组，分为2组；6例健康对照血清，3例合成一组，分为2组；入组标准见1.1节样品收集。Protein G去除血清蛋白质中的IgG， Con A富集高甘露糖型N-糖蛋白质，方法参考1.3.1.1节Con A富集高甘露糖型血清糖蛋白。 2） FASP（filter aided sample preparation）酶解法胰蛋白酶酶切。蛋白质样品加入10 mmol/L二硫苏糖醇于37 ℃孵育1 h，40 mmol/L碘代乙酰胺室温避光孵育15 min，加入胰蛋白酶37 ℃孵育过夜，回收多肽混合物，真空冷冻成干粉。 3） iTRAQ 标记。用20 mmol/L三乙胺碳酸缓冲液（TEAB）重悬酶切多肽混合物并将每组样品分为两份。从冰箱取出iTRAQ八标标记试剂，平衡到室温。瞬时离心，向每管iTRAQ试剂中加入异丙醇，涡旋振荡溶解，瞬时离心。将制备好的iTRAQ标记试剂分别添加到酶切多肽混合物中，加样顺序如下：第一组健康对照组分别加入iTRAQ标记试剂113和114，第一组T2DM组分别加入iTRAQ标记试剂115和116，第二组健康对照组分别加入iTRAQ标记试剂117和118，第二组T2DM组分别加入iTRAQ标记试剂119和121。涡旋振荡混匀并瞬时离心，室温反应2 h，加入100 μL去离子水终止反应（30 min）。标记结束后，8组样品混合，真空冷冻干燥机旋干混合多肽样品。 4） LC-MS/MS分离分析。用30 μL 0.1%甲酸/2%乙腈重悬标记后多肽样品，LC-MS/MS进行分析，上样泵流速2 μL/min， 16 min，分离流速0.3 μL/min，流动相A为2%乙腈/0.1%甲酸，流动相B为98%乙腈/0.1%甲酸。0.1 min至60 min流动相B从8%逐渐增至24%； 60~85 min，流动相B从24%逐渐增至45%；86~90 min，使用80%流动相B冲洗；最终（91~100 min），流动相B恢复至5%。质谱（MS）参数设置如下：离子喷雾电压2.3 kV， 去簇电压80 V，扫描质荷比范围100~1 500，动态排出时间25 s。 5） 质谱数据分析。质谱数据使用Protein Pilot TM Software 4.5软件检索分析，检索条件：样品类型iTRAQ八标（多肽标记）。半胱氨酸修饰：碘代乙酰胺。蛋白酶种类：胰蛋白酶。修饰类别：生物修饰。数据库：SwissProt， Homo sapiens。结果依据蛋白得分（Unused ProtScore） > 0.05筛选过滤。 1.3.5　统计学分析 3 使用Graphpad prism 5.0软件对数据进行统计和分析，T2DM组和健康对照组之间的比较采用非配对双尾 t 检验（Unpaired t test），具有统计学意义标准： p < 0.05。 2　 结 果 1 2.1　T2DM组血清Afamin蛋白质浓度变化 2 以考马斯亮蓝染色定量选取样本的血清总蛋白质的量，并以此为依据校正Western Blot实验中各样本的上样量。随机选取T2DM组（或健康对照组）6例血样，每两例混合为1个血样，得到3份T2DM1~3血样（或CON1~3），分析血清Afamin蛋白质浓度的变化。如 图1 图1 A所示，与健康对照组相比，T2DM组血清中Afamin灰度明显较高。非配对双尾 t 检验分析Western Blot显示的相对浓度，如 图1 图1 B所示，T2DM组血清Afamin相对浓度显著上调（ p =0.010 1）。 A:Western Blot图；B:血清Afamin的相对浓度；M为Marker A: Western Blot; B: The relative concentration of serum Afamin; M: Marker ELISA法测定46例T2DM病人和26例健康对照者血清Afamin浓度，结果显示T2DM组血清Afamin浓度为6.03±0.19 μg/mL，健康对照组血清Afamin浓度为5.07±2.12 μg/mL，且T2DM组与健康对照组血清总Afamin浓度具有显著性差异（ p =0.001 9）（ 图2 图2 ），即T2DM组较健康对照组血清总Afamin浓度显著性上调。ELISA法测得数据与Western Blot数据变化趋势一致，进一步验证了T2DM病人血清Afamin呈显著性上调这一变化趋势。 2.2　血清Afamin高甘露糖型糖基化修饰的异质性分析 2 Western Blot分析等质量血清蛋白质（crude serum）、Con A亲和层析流穿蛋白质（the flow through）以及洗脱蛋白质（the eluate）。 图3 图3 结果显示：原血清蛋白质和洗脱蛋白质样品中均检测到Afamin，流穿液蛋白质样品中未检测到Afamin，即血清中Afamin被Con A结合。根据Con A特异性结合高甘露糖型糖蛋白性质，得到进一步结论，血清Afamin均存在高甘露糖型糖基化修饰。 2.3　T2DM组高甘露糖型Afamin蛋白质浓度变化 2 同位素标记效率是决定iTRAQ实验成败的关键因素，本研究中赖氨酸K上的同位素标记效率为100%，N端标记效率约为95%。 检测到可信度不小于95%的Afamin肽段165条，其中非冗余肽段26条，部分肽段的LC-MS/MS图谱如 图4 图4 A，B所示。检测到Afamin肽段的氨基酸覆盖率达到65.9%，可信度不小于95%的肽段的氨基酸覆盖率达到35.56%。同时，在匹配成功的Afamin肽段的LC-MS/MS图谱中出现了 N -乙酰氨基葡萄糖（ N -acetylhexosamine， HexNAc， m/z 138.06， m/z 204.09）、唾液酸（ N -acetylneuraminic acid， NeuAc， m/z 274.10， m/z 292.11）以及甘露糖+ N -乙酰氨基葡萄糖366.14（Hex（hexose）+ HexNAc）等特征性糖苷碎片离子 ［ 27 27 ~ 30 30 27~30 ］ 。iTRAQ定量分析结果（略）显示，与健康对照相比较，高甘露糖型Afamin在T2DM组血清中呈显著性上调（iTRAQ相对定量数据显示，T2DM组血清蛋白质Afamin是健康对照组血清蛋白质Afamin的2倍甚至更多，且 p < 0.05）。 A： SDVGFLPPFPTLDPEEK；B： VNCLQTRAIPVTQY 利用Western Blot分析T2DM组Con A富集高甘露糖型Afamin的差异，结果如 图5 图5 A，B所示，显示高甘露糖型Afamin在T2DM组血清中显著性上调（ p =0.046 2）。 A：Western Blot图；B：高甘露糖型Afamin的相对浓度 A: Western Blot; B: The relative concentration of high mannose type Afamin 3　 讨 论 1 虽然动物实验及流行病学调查数据显示，血清Afamin上调与体重、腰围、血脂、血糖胰岛素抵抗等T2DM发病高危因素密切相关 ［ 3 3 ， 19 19 ］ ，且Afamin可通过激活Wnt通路增加T2DM的易感性 ［ 10 10 ~ 14 14 10~14 ］ 。但目前将Afamin与T2DM直接关联的研究很少。本研究将血清Afamin、高甘露糖型Afamin与T2DM进行关联，结果显示，T2DM病人血清Afamin呈上调趋势，且这一变化趋势与之前的流行病学调查数据相吻合 ［ 9 9 ］ 。 以往Afamin功能研究显示，一方面，Afamin能够特异性转运抗氧化剂维生素E ［ 6 6 ］ ，而维生素E可以减轻氧化应激 ［ 12 12 ］ 。T2DM病人体内转运维生素E的载体Afamin浓度上调，抗氧化能力应当增强，缓解氧化应激能力也应增强，然而事实是T2DM病人的氧化应激并未得到有效缓解。这可能是由于T2DM病人的Afamin转运维生素E的能力减弱，影响了抗氧化能力所致。另一方面，Afamin可通过调节糖代谢相关酶如葡萄糖转运蛋白甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、己糖激酶2的表达促进葡萄糖吸收代谢 ［ 15 15 ］ 。然而T2DM病人的Afamin浓度上调并未有效缓解T2DM的高血糖状况，可能是由于其血清Afamin的促葡萄糖吸收代谢能力减弱所致。推测T2DM病人血清Afamin上述两方面能力减弱的原因可能是Afamin的三维结构发生了改变，即Afamin的糖基化修饰状态的改变减弱了它转运维生素E和促进葡萄糖代谢吸收的能力。 以往研究数据显示Afamin是一种糖蛋白 ［ 6 6 ］ ，而本研究数据进一步揭示，血清Afamin都存在高甘露糖型糖链，这一发现在以往的研究中未提及。本研究还发现，Con A富集所得高甘露糖型血清Afamin在T2DM中显著性上调。高甘露糖型糖链是一种N-连接型糖链，在正确折叠的蛋白从内质网转移至高尔基体过程中发挥重要作用 ［ 31 31 ］ 。高甘露糖型糖链的变化与疾病密切相关，T2DM病人以及糖尿病肾病血清中Con A结合的高甘露糖型Apo A4的增高或可预测糖尿病病人的肾脏损伤程度 ［ 32 32 ］ ，而胆管瘤病人血清中高甘露糖的上调可能与其肿瘤的发展相关 ［ 33 33 ］ 。本研究还显示T2DM病人血清高甘露糖型Afamin浓度上调，可能是由Afamin的总表达量上调引起的，也可能是T2DM病人血清中高甘露糖型Afamin的比例增高的结果，或两者兼有。结合T2DM病人血清Afamin增高与其功能的结果，极有可能是高甘露糖型Afamin的比例发生了改变，甚至是糖基化结构发生改变，使Afamin构象发生变化，影响了Afamin的生物功能。这些推测还需要进一步的实验数据支撑，有待更深层次的研究。 4　 结 语 1 本研究通过Western Blot、ELISA、iTRAQ等方法探讨并验证T2DM病人中血清总Afamin以及高甘露糖型Afamin的变化趋势，并结合Con A亲和层析和Western Blot分析血清Afamin的高甘露糖型糖基化修饰异质性。实验结果表明，血清Afamin在T2DM病人中发生显著上调，所有Afamin都存在高甘露糖型糖链，且高甘露糖型血清Afamin在T2DM病人中也发生显著性上调。有关Afamin高甘露糖基化修饰及其在T2DM病人中的变化这一结论在已发表文献中尚未提及。这一发现可望为进一步探究Afamin在T2DM发生发展中的作用提供实验依据。T2DM中血清Afamin的糖代谢功能可能被糖基化修饰影响，从而导致胰岛素抵抗，这一推测还有待深入研究。 参考文献 RIAZ S ， ALAM S S ， AKHTAR M W . 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