高效溶藻放线菌LW9的分离鉴定及其溶藻特性

高效溶藻放线菌LW9的分离鉴定及其溶藻特性 Isolation and Identification of an Efficient Algicidal Actinomycetes Strain LW9 and Its Algicidal Characteristics 1 2 first-author 王素钦，女，博士，讲师，主要从事蓝藻环境生物学研究。E-mail：suqinwanghn@outlook.com 王素钦，女，博士，讲师，主要从事蓝藻环境生物学研究。E-mail：suqinwanghn@outlook.com suqinwanghn@outlook.com 1 1 1 1 corresp E-mail： luofish@huas.edu.cn E-mail： luofish@huas.edu.cn luofish@huas.edu.cn 2 corresp gannq@ihb.ac.cn gannq@ihb.ac.cn gannq@ihb.ac.cn 湖南文理学院 环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室/水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室/水产生物资源与环境生态湖南省工程研究中心/常德市农业生物大分子研究中心，湖南 常德 415000 湖南文理学院 环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室/水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室/水产生物资源与环境生态湖南省工程研究中心/常德市农业生物大分子研究中心，湖南 常德 415000 Hunan Key Laboratory for Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area/Hunan Key Laboratory for Molecular Immunity Technology of Aquatic Animal Diseases/Engineering Research Center of Aquatic Organism Resources and Environmental Ecology of Hunan Province/Changde Research Center for Agricultural Biomacromolecule， Hunan University of Arts and Science， Changde 415000， Hunan， China Hunan Key Laboratory for Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area/Hunan Key Laboratory for Molecular Immunity Technology of Aquatic Animal Diseases/Engineering Research Center of Aquatic Organism Resources and Environmental Ecology of Hunan Province/Changde Research Center for Agricultural Biomacromolecule， Hunan University of Arts and Science， Changde 415000， Hunan， China 中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北 武汉 430072 中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北 武汉 430072 Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences/State Key Laboratory of Fresh Water Ecology and Biotechnology，Wuhan 430072， Hubei， China Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences/State Key Laboratory of Fresh Water Ecology and Biotechnology，Wuhan 430072， Hubei， China 从土壤中分离筛选出1株具有高效溶藻活性的放线菌LW9，利用形态学特征和16S rRNA序列对放线菌LW9进行分子生物学鉴定，并对其溶藻特性进行研究。结果表明：放线菌LW9属于链霉菌属成员，与菲律宾链霉菌（ Streptomyces filipinesis ）同源相似性达99.0%；LW9主要通过分泌胞外活性物质溶藻，其溶藻活性物质主要在菌株生长稳定期积累，且在高温、酸性和碱性环境以及紫外光照射条件下均具有较好的稳定性；LW9发酵液以5%（体积分数）的剂量作用于常见的水华蓝藻如微囊藻、束丝藻和颤藻，均表现出明显的溶藻效果，溶藻率达79%~94%。鉴于其溶藻能力的稳定性、高效性，LW9可作为开发微生物控藻菌剂的候选菌株。 One actinomycete strain LW9 with algae-lysing activity was isolated from soil. The taxonomic status of actinomycete Strain LW9 was determined on the bases of morphological characteristics and 16S rRNA gene sequences. Its algicidal characteristics were also investigated. The results show that Strain LW9 is a member of the genus of Streptomyces , and shows 99.0% similarity with that of Streptomyces filipinesis. The algicidal mechanism of Strain LW9 is mainly by releasing extracellular active compound, which mainly accumulates during the stationary period, and this compound has good stability under high temperature, acidic or alkali pH and UV irradiation conditions; common bloom-forming cyanobacteria species like Microcystis , Aphanizomenon and Oscillatoria can be lysed by 5%（volume fraction）fermentation filtrate of Strain LW9, and the algicidal rates are around 79%-94%. In view of its stability and high efficiency, Strain LW9 can be the candidate for developing into a micro-biological algicidal agent. 溶藻放线菌 分离鉴定 溶藻特性 水华蓝藻 algicidal actinomycetes isolation and identification algicidal characteristics bloom-forming cyanobacteria 0　 引 言 1 随着全球气候变暖和水体富营养化程度的加剧，蓝藻水华频繁暴发，呈现出发生范围广、持续时间长、生物量高的特征，已成为世界性的生态环境问题 ［ 1 1 ， 2 2 ］ 。蓝藻水华不仅引发淡水生态系统结构和功能失衡，还能产生有害次级代谢产物，如蓝藻毒素、异味物质等，严重影响饮用水安全，危害人类健康 ［ 3 3 ， 4 4 ］ 。因此，研发经济、有效且安全的控藻技术具有重要的生态学和社会学意义。 当前藻类的控制方法主要包括物理法、化学法和生物法。依赖于机械打捞的物理方法和CuSO 4 等杀藻剂的化学方法存在治理成本高、选择性差，易对环境产生二次污染的缺点 ［ 5 5 ~ 8 8 5~8 ］ 。而基于现代生态环保理念的微生物控藻技术具有经济、高效、环境友好的优势 ［ 9 9 ， 10 10 ］ ，受到国内外研究者广泛关注。微生物控藻技术是指利用噬藻体（cyanophage）、细菌（bacteria）、放线菌（actinomycetes）、真菌（fungi）和原生动物（protozoa）等微生物来控制蓝藻水华。噬藻体是以蓝藻为宿主的病毒，可通过直接侵染的方式裂解藻细胞 ［ 11 11 ］ 。细菌的溶藻方式包括直接作用和间接作用两种，少数溶藻细菌如黏细菌属（ Myxobacter ） ［ 12 12 ］ 、噬胞菌属（ Cytophaga ） ［ 13 13 ］ 和假交替单胞菌属（ Pseudoalteromonas ） ［ 14 14 ］ 可通过与藻细胞的直接接触破坏细胞壁，裂解藻细胞。大部分溶藻细菌如芽孢杆菌属（ Bacillus ）、假单胞菌属（ Pseudomonas ）、鞘氨醇单胞菌属（ Sphingomonas ）等，可通过向环境中释放蛋白质、多肽、氨基酸、生物碱等溶藻活性物质间接溶藻 ［ 15 15 ］ 。真菌和放线菌主要也是通过释放活性物质产生间接溶藻作用 ［ 9 9 ］ 。这些胞外活性物质可以通过破坏细胞结构、抑制光合作用以及引起细胞氧化胁迫等多种途径实现溶藻作用 ［ 9 9 ， 15 15 ］ 。原生动物如变形虫（ Amoeba ）、棕鞭毛虫（ Ochromonas ）和纤毛虫（ Ciliophora ）等则通过摄食微藻影响水华生消 ［ 16 16 ， 17 17 ］ 。 目前控藻微生物的研究主要围绕溶解微囊藻的细菌展开 ［ 18 18 ， 19 19 ］ ，而对于其他丝状蓝藻的溶藻细菌报道相对较少，且大多数溶藻细菌仅对单细胞的微囊藻具有溶藻效果，而对自然水体环境下的群体微囊藻溶藻效果甚微 ［ 20 20 ］ 。本研究通过从土壤中分离出一株具有高效溶藻作用的放线菌LW9，对其进行形态及分子生物学鉴定，并对其溶藻方式、溶藻物质的稳定性以及对常见水华蓝藻的溶藻效果等特性进行探究，以期初步评价该菌在研发控藻菌剂方面的潜力。 1　 材料和方法 1 1.1　藻株及培养 2 实验藻株铜绿微囊藻FACHB 905、铜绿微囊藻PCC 7806、群体铜绿微囊藻TH 1701、柔细束丝藻（ Aphanizomenon gracile ）FACHB 1039、鱼腥藻（ Anabaena sp.）PCC 7120和颤藻（ Oscillatoria sp.）PCC 6506均来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库（Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology，FACHB-Collection）。藻株培养条件：BG-11培养基 ［ 21 21 ］ ，光照强度为25 µmol·m -2 ·s -1 ，光暗周期比为12 h/12 h，温度为25 ±1 ℃，培养至对数生长期。 1.2　溶藻放线菌的分离、筛选及鉴定 2 1.2.1　分离与筛选 3 1） 采样 4 土壤样品采自常德市市郊某肥沃菜园，采用随机五点采样法，取距离地表3~5 cm深的土壤，将其均匀混合后装入无菌袋中带回实验室，自然风干后研磨成粉末。取10 g上述土壤样品，放入装有适量玻璃珠和90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，振荡20 min，使泥土与无菌水充分混合，制成土壤悬液。 2） 放线菌分离纯化 4 采用梯度稀释法将上述土壤悬液涂布至高氏1号固体平板上，置于恒温培养箱28 ℃培养8 d。挑取不同形态放线菌菌落以“Z”字划线法反复分离纯化3~4次。挑取纯化后的单菌落接种至高氏1号试管斜面，28 ℃培养7 d后于冰箱中4 ℃保存备用。 3） 放线菌发酵培养 4 菌种接种至高氏1号液体培养基，28 ℃ 180 r/min摇床培养7 d。 4） 溶藻放线菌的筛选 4 初筛：采用双层藻平板法 ［ 22 22 ］ ，取对数生长期的铜绿微囊藻FACHB 905藻液，以1∶1 （体积比）的比例加入到冷却至50 ℃的BG-11固体培养基（琼脂终浓度为1%）中，混匀后倒至底层为已凝固的BG-11固体平板（琼脂浓度为1%）上，迅速均匀铺平冷却，于25 ℃、25 µmol·m -2 ·s -1 光照条件下培养5 d。使用1 mL的无菌移液枪头顶端在双层藻平板中央打圆形孔，向孔中加入放线菌发酵液100 µL，正面置于25 ℃、25 µmol·m -2 ·s -1 光照条件下共培养5 d，观察是否产生溶藻圈。 复筛：采用液体感染法，将初筛得到的放线菌发酵液以5%（体积分数）的比例加入到铜绿微囊藻FACHB 905对数生长期的藻液中，空白对照组加入等体积无菌水，于25 ℃、25 µmol·m -2 ·s -1 条件下培养，观察藻液是否发生黄化。 1.2.2　形态观察与分子鉴定 3 1） 菌株LW9形态特征观察 4 菌株LW9在高氏1号固体培养基上28 ℃恒温培养10 d，利用M205型高级体式显微镜（Leica公司）观察并记录放线菌LW9的菌落特征（形状、菌苔颜色、色素有无等）；利用DM3000型高分辨率显微成像系统（Leica公司）观察纪录菌丝形态。 2） 菌株LW9 16S rRNA分子生物学鉴定 4 使用MP FastDNA SpinDown Kit土壤DNA提取试剂盒（MP Biomedicals公司）提取溶藻放线菌基因组DNA，操作流程参照说明书。DNA的浓度和纯度使用NanoDrop 8000型超微分光光度计（Thermo Fischer公司）进行测定。采用细菌16S rDNA的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。扩增条件为94 ℃预变性5 min；随后进行30个循环：94 ℃预变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min。纯化后的PCR扩增产物送往上海生物工程有限公司进行测序，所得16S rDNA序列在NCBI 数据库进行Blast比对分析，利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（Neighbour-Joining method）构建菌株LW9系统发育树。 1.3　溶藻特性研究 2 1.3.1　菌株LW9溶藻作用方式探究 3 为探究LW9的溶藻方式，收集培养7 d的菌株LW9发酵液，6 000 r/min离心8 min，分别收集上清液和沉淀菌体。上清液经0.22 μm滤膜（Millipore公司）过滤，菌体则用无菌水反复清洗5次，以除去培养液，最后加入等体积无菌水制成重悬液。分别将菌株LW9的上清液、菌体重悬液和原发酵液以5%（体积分数）的比例加入到30 mL铜绿微囊藻FACHB-905的对数生长期藻液中，以无菌水为空白对照，每组实验设3组平行，于第5天取样，采用乙醇法 ［ 23 23 ］ 测定藻液叶绿素 a （Chlorophyll a ，Chl a ）的含量。 1.3.2　菌株LW9溶藻物质稳定性测试 3 取菌株LW9培养7 d的发酵液经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液分别进行以下处理：1） 酸碱处理，分别用1.0 mol/L HCl和NaOH 溶液，将样品pH 值调至3.5和9.5（原发酵上清液pH值为6.5），室温条件下放置1 h后再调回原始值；2）热处理，样品置于100 ℃水浴加热1 h后冷却到室温；3）紫外光照射处理，样品置于超净工作台，365 nm紫外光照射1 h。参照1.2.1中双层藻平板法，检测不同处理组中溶藻物质的活性变化，设置无菌水为空白对照，未处理样品为阳性对照，每组实验设3组平行。于25 ℃、25 µmol·m -2 ·s -1 光照条件下培养5 d，观察并记录各组溶藻圈的直径 d （mm）。 1.3.3　菌株LW9不同生长时期发酵液的溶藻效果 3 为探究不同生长时期的菌株LW9发酵液的溶藻活性，菌株LW9在28 ℃、 180 r/min摇床培养条件下生长，分别取延滞期（第3天）、对数期（第5天）、稳定期（第7天）和衰亡期（第10天）的发酵液，6 500 r/min离心10 min，保留上清液，以0.22 μm滤膜过滤，再以5%（体积分数）的比例将无菌滤液加入到30 mL铜绿微囊藻FACHB 905对数培养期藻液中，混匀，置于25 ℃、25 µmol·m -2 ·s -1 光照条件中培养，每组实验设3组平行，于第5天取样，测定藻液Chl a 含量，按（1）式计算各组溶藻率（%） ［ 24 24 ］ 。 溶藻率= ［（ρ CK -ρ T ）/ ρ CK ］ × 100% 其中， ρ CK （mg/L）表示对照组Chl a 的质量浓度， ρ T （mg/L）表示处理组Chl a 的质量浓度。 1.3.4　对不同种类水华蓝藻的溶藻效果 3 为探究菌株LW9对不同种类水华蓝藻的溶藻效果，取菌株LW9经0.22 μm滤膜过滤的发酵液以5%（体积分数）的比例添加到铜绿微囊藻PCC 7806、群体铜绿微囊藻TH 1701、柔细束丝藻FACHB 1039、鱼腥藻PCC 7120和颤藻PCC 6505藻液中，于100 mL三角瓶中光照条件下培养。由于颤藻PCC 6505的藻丝容易结团，为尽量保证取样均匀，在其三角瓶中加入了少量玻璃珠，取样前在摇床上160 r/min振荡约30 min，使藻丝均匀分散。以添加无菌水为空白对照，实验设置3组平行，观察并记录各组藻液是否发生黄化，显微观察藻细胞形态变化。每隔2 d取样一次，测定Chl a 含量，采用Phyto-PAM型浮游植物荧光仪（Walz公司）测定光合系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学量子产量 F v / F m （ F v 指暗适应状态下的最大可变荧光产率； F v = F m - F o ， F m 指在暗适应状态下当PSⅡ的所有反应中心处于完全关闭状态的最大荧光产率， F o 指在暗适应状态下当PSⅡ的所有反应中心处于开放状态的初始荧光产率） ［ 25 25 ］ 。样品测定前需暗适应10 min。 1.3.5　溶藻效果电镜观察 3 按文献［ 26 26 ］的制样方法，取适量经LW9除菌发酵液处理4 d的群体铜绿微囊藻TH 1701藻细胞，6 500 r/min离心10 min，收集藻细胞，加入2.0%（体积分数）的戊二醛，于4 ℃下固定2 h，制备电镜切片样品，使用HT-7700型透射电子显微镜（TEM，日立公司）观察细胞内部结构形态。 1.4　数据整理与统计分析 2 采用Excel 2010对实验数据进行处理，利用SPSS 14.0进行单因素方差分析（One-way Anova），数据绘图用Origin 8.0和Excel 2010完成。 2　 结果与分析 1 2.1　溶藻放线菌的鉴定 2 2.1.1　溶藻放线菌的形态及溶藻活性 3 本实验共分离纯化获得12株土壤放线菌，采用双层藻平板法对12株放线菌的溶藻效果进行检测筛选，获得1株溶藻放线菌LW9，其形态如 图1 图1 所示。菌株LW9在高氏1号固体培养基上的菌落形态一般呈圆形、表面较为干燥、质地紧密，产生黄色色素，不同菌落间存在明显界线（ 图1 图1 A），菌体发达、呈棉絮状、菌丝纤细、有较多分支且相互紧密缠绕（ 图1 图1 B）。菌株LW9的溶藻圈直径 d 在5 d后达50.0 mm（ 图2 图2 A）；复筛结果显示，添加菌株LW9发酵液3 d后，藻细胞发生聚集下沉，并产生明显的黄化现象；5 d后藻液变得澄清透明（ 图2 图2 B）。上述结果表明菌株LW9具有较强溶藻活性，因此本实验以LW9作为出发菌株开展进一步研究。 A：在藻平板上形成的溶藻圈；B：溶解铜绿微囊藻藻液对比（CK为对照组，T为处理组） A: The lysis zone formed on M. aeruginosa agar plate; B: Comparition between the lysate and the normal M. aeruginosa cultures (CK: control, T: treatment） 2.1.2　菌株LW9的16S rRNA基因序列分析 3 利用菌株LW9的16S rRNA 基因序列进行比对分析，构建系统发育树，结果如 图3 图3 所示。结果表明，该菌为链霉菌属（ Streptomyces ）成员，与 Streptomyces filipinesis strain NBRC 12860位于同一个分支，同源相似性达99.0 %，初步鉴定为菲律宾链霉菌。 2.2　菌株LW9的溶藻方式 2 图4 图4 所示为菌株LW9不同处理液的溶藻效果，初始浓度为1.52 mg/L的铜绿微囊藻培养至第5天，对照组藻液生长状况良好，Chl a 浓度为3.82±0.17 mg/L；添加5%（体积分数）放线菌LW9上清液和发酵液处理组藻液生长受到明显的抑制，藻液发生黄化现象，Chl a 浓度分别为1.09±0.16 mg/L和0.96±0.18 mg/L，显著低于对照组（ p< 0.05），共培养5 d后的溶藻率分别为71.39%和74.80%；菌体重悬液对铜绿微囊藻的生长也具有轻微抑制作用，共培养5 d后Chl a 浓度为2.98±0.19 mg/L，溶藻率为21.85%。LW9上清液的溶藻率高于菌体重悬液，因此初步判断菌株LW9主要为间接方式溶藻，即通过分泌胞外活性物质溶藻。 2.3　溶藻物质的稳定性 2 采用双层藻平板法测定菌株LW9溶藻物质的酸碱稳定性、热稳定性以及紫外光照射耐受性。实验结果如 图5 图5 所示，不同处理条件下的LW9除菌发酵液样品均能够在双层藻平板上形成透明溶藻圈，各处理组溶藻圈直径（ 图5 图5 B~E， d =49.0~52.0 mm， t =5 d）和未处理组（ 图5 图5 A， d =52.5 mm， t =5 d）相比无显著性差异（ p > 0.05），说明菌株LW9产生的溶藻活性物质具有很好的酸碱稳定性、热稳定性以及紫外线耐受性。 CK：空白对照；A：未处理；B：pH 3.5酸处理；C：pH 9.5碱处理；D：热处理；E：紫外光照射处理 CK: blank control; A: no treatment; B: pH 3.5 acid treatment; C: pH 9.5 alkali treatment; D: heat treatment; E: UV irradiation treatment 2.4　不同生长期发酵液的溶藻效果 2 图6 图6 所示为菌株LW9不同生长期发酵液的溶藻效果，菌株LW9在延滞期未表现出明显的溶藻活性，在对数期溶藻率为36.93%，说明在此阶段菌株LW9已开始分泌溶藻活性物质，溶藻率在稳定期（88.18%）和衰亡期（93.95%）明显上升，表明两阶段菌株LW9的发酵液中已积累较多的溶藻活性物质，具有较好溶藻效果。 2.5　菌株LW9对不同种类水华蓝藻的溶藻效果 2 2.5.1　菌株LW9对水华蓝藻外部形态影响 3 菌株 LW9 对5株蓝藻外部形态的影响如 图7 图7 A和B所示。 1） 铜绿微囊藻PCC 7806 4 添加LW9发酵液处理3 d后，铜绿微囊藻PCC 7806藻液即出现明显黄化，细胞下沉，5 d后藻液变澄清透明（ 图7 图7 A）。显微观察（ 图7 图7 B）可见对照组细胞呈蓝绿椭圆形，细胞壁边缘光滑完整，可见较多生长旺盛的二分裂状态细胞，而处理组视野中大部分藻细胞发生裂解，呈现较多灰黄色细胞碎片，处理组少数未裂解细胞的细胞壁边缘皱缩。 2） 群体铜绿微囊藻TH 1701 4 群体状态的铜绿微囊藻TH 1701在处理4 d后可见明显黄化（ 图7 图7 A）。显微观察（ 图7 图7 B）可见对照组群体胶被（sheath）细胞结构致密，呈鲜艳蓝绿色椭圆形，而处理组群体细胞呈灰黄色，群体细胞胶被结构明显松散，部分细胞形态发生改变。 3） 柔细束丝藻FACHB 1039 4 束丝藻细胞比铜绿微囊藻细胞对LW9溶藻物质更为敏感，处理3 d后，处理组藻丝完全下沉，藻液澄清透明（ 图7 图7 A）。显微观察（ 图7 图7 B）可见藻丝断裂，伪空胞大量减少，藻丝体外围出现较多细菌。 4） 颤藻PCC 6506 4 对照组颤藻PCC 6506藻丝长，呈蓝绿色，易形成藻丝团，处理组在实验4 d后藻丝发生明显黄化，藻丝下沉（ 图7 图7 A）。显微观察（ 图7 图7 B）可见藻丝发生断裂，细胞结构破坏，细胞基质外溢，细胞质空化。 5） 鱼腥藻PCC 7120 4 与以上4株蓝藻现象不同，添加 LW9无菌发酵液10 d后仍未观察到鱼腥藻PCC 7120细胞发生黄化现象（ 图7 图7 A）。显微观察（ 图7 图7 B）可见处理组藻丝细胞形态完好，未见明显藻丝断裂和细胞裂解现象，但有部分藻丝出现聚集现象。 2.5.2　对蓝藻生长及光合活性影响 3 Chl a 是表征浮游植物生物量的常用指标。由 图8 图8 A~D可见，铜绿微囊藻PCC 7806、群体铜绿微囊藻TH 1701、柔细束丝藻FACHB 1039、颤藻PCC 6505对照组藻液生长状况良好，Chl a 浓度均随着培养天数增加而逐渐升高，而铜绿微囊藻PCC 7806、柔细束丝藻FACHB 1039、颤藻PCC 6505各处理组Chl a 浓度均从第2天开始逐渐下降（ p< 0.01），群体铜绿微囊藻TH 1701处理组Chl a 浓度从第4天开始逐渐下降（ p< 0.01），说明这些处理组的藻细胞生长均受到了显著的抑制。在处理第10天时，LW9除菌发酵液对4株藻的溶藻率分别为：铜绿微囊藻PCC 7806 86.99%、群体铜绿微囊藻TH 1701 79.06%、柔细束丝藻FACHB 1039 94.02%和颤藻PCC 6505 89.76%。与上述结果不同的是，鱼腥藻PCC 7120处理组（ 图8 图8 E）藻细胞生长未受到显著抑制，其Chl a 浓度与对照组相比无显著性差异（ p > 0.05）。 F v / F m 是细胞光合活性的重要指示参数，在正常生理状态下该数值稳定，而在遭受生理胁迫时明显下降 ［ 27 27 ］ 。由 图8 图8 A~D可见，铜绿微囊藻PCC 7806、群体铜绿微囊藻TH 1701、柔细束丝藻FACHB 1039、颤藻PCC 6505对照组 F v / F m 值一直处于正常稳定水平，而处理组 F v / F m 值随处理天数的增加呈显著下降趋势（ p< 0.05），处理第10天四组 F v / F m 值均降至0.1以下，表明LW9溶藻活性物质能够显著抑制藻细胞的光合活性，其中柔细束丝藻FACHB 1039和颤藻PCC 6505表现得较敏感，在处理第4天时 F v / F m 值即降至0.1以下。与上述4株藻不同，鱼腥藻PCC 7120处理组（ 图8 图8 E）与对照组 F v / F m 值在实验6 d内波动范围为0.44~0.50，两组之间无显著性差异（ p > 0.05），而在处理第8天后处理组 F v / F m 值降为0.37~0.38。 综上，LW9溶藻活性物质对铜绿微囊藻PCC 7806、群体铜绿微囊藻TH 1701、柔细束丝藻FACHB 1039和颤藻PCC 6506藻液具有显著的溶藻效果，其中LW9溶藻物质对束丝藻的溶藻效率最高（94.02%），对单细胞微囊藻的溶藻效率（86.99%）高于群体微囊藻（79.06%）。LW9的溶藻物质可以破坏藻细胞结构，抑制藻细胞生长，降低光合系统活性，但对鱼腥藻PCC 7120溶藻效果不显著。 2.6　溶藻效果亚显微结构观察 2 图9 图9 所示为菌株LW9发酵液对群体铜绿微囊藻TH 1701细胞内部结构的影响，结果表明，菌株LW9的溶藻物质能明显破坏微囊藻细胞的细胞壁及内部结构。对照组群体铜绿微囊藻细胞（ 图9 图9 A）细胞壁（cell wall）结构完整，外围均匀地围绕着一层较薄的胶被，胞质内各种细胞器结构清晰可见，蜂巢状（横面）或一堆堆圆柱状（纵面）的结构为伪空胞（gas vesicle），多层扁平膜状片层结构为类囊体（thylakoid），其上附着很多小颗粒状色素，而处理组微囊藻细胞（ 图9 图9 B）的细胞壁及胶被层边缘模糊扩散，胞质内伪空胞、类囊体等结构模糊难以辨别。伪空胞的破坏与 图7 图7 中细胞大多发生下沉的现象相吻合。对LW9溶藻机制的阐明还需要更多的实验数据支撑。 3　 讨 论 1 放线菌是一类丝状、可产生孢子、高（G+C）碱基比例的革兰氏阳性细菌，在水陆环境中广泛存在，可产生包括抗生素、有机酸、生物碱等在内的多种次级代谢产物 ［ 28 28 ， 29 29 ］ ，是开发具有经济价值天然活性物质的重要微生物资源。目前已报道具有溶藻作用的放线菌多为链霉菌属成员，种类包括 S. neyagawaensis ［ 30 30 ］ 、S. jiujiangensis ［ 31 31 ］ 、S. lushanensis ［ 32 32 ］ 、S. eurocificus ［ 33 33 ］ 、S. phaeofaciens ［ 34 34 ］ 和 S. exfoliates ［ 22 22 ］ 等。但目前仅少数放线菌的抑藻活性物质被鉴定，包括nanaomycin A merthyl ester （NAME） ［ 30 30 ］ 和三萜皂苷（2-hydroxy-12-oleanene-3，28-O- D -glucopyranosyl） ［ 35 35 ］ 等。本研究报道了一株菲律宾链霉菌（ Streptomyces filipinesis ）LW9的溶藻活性，其溶藻圈直径在5 d后可达50.0 mm。文献报道菲律宾链霉菌能够分泌产生菲律宾菌素（filipin）、头霉素C（cephamycin C）、潮霉素A（hygromycin A）等抗生素类物质 ［ 36 36 ~ 38 38 36~38 ］ ，但这些物质是否具有抑藻活性尚未见研究。 为探究菌株LW9的溶藻方式，考察了LW9的上清液、菌体重悬液和发酵液的溶藻效果，结果表明，上清液不含有菌体但具有较强的溶藻效果，说明菌株LW9分泌了某类胞外活性物质产生了间接溶藻作用。菌体重悬液不含培养物，表现出较低的溶藻效果，原因可能是菌体在与藻培养过程中继续分泌了少量溶藻活性物质，或者菌体通过对细胞的直接作用产生抑藻效果。 菌株LW9的溶藻活性物质主要在其生长的稳定期积累，化学性质稳定，在高温（100 ℃）、酸性（pH 3.5）和碱性（pH 9.5）环境以及紫外光照射的条件下均保持较高溶藻活性（ d = 49.0~52.0 mm， t = 5 d）。这将有利于后续研究中对其活性物质的提取、纯化以及结构研究，也为在野外水体中长时间发挥溶藻效果提供可能。后期纯化过程中发现该溶藻物质易溶于水，可通过3×10 3 超滤管，且不能被蛋白酶水解，因此推测其属于非蛋白类极性小分子化合物。 野外水体中的微囊藻是以群体的形式存在，细胞因多糖黏液层包裹而成为群体，具有更强的抗胁迫能力 ［ 39 39 ］ 。此外，湖泊等自然水体环境的改变也会出现微囊藻水华与束丝藻、鱼腥藻等优势丝状蓝藻水华共存或演替的现象，增加了对蓝藻水华去除的难度。本研究中放线菌LW9菌株产生的溶藻活性物质对单细胞和群体细胞微囊藻均具有溶藻效果，但单细胞微囊藻的溶藻效率（86.99%）高于群体微囊藻（79.06%），说明群体微囊藻的防御溶藻菌能力高于单细胞微囊藻；此外LW9对常见丝状水华蓝藻束丝藻、颤藻也具有溶藻作用，对束丝藻的溶藻率高达94%。于燕 ［ 40 40 ］ 分离到一株链霉菌HG-16，以5%（体积分数）比例与不同株的铜绿微囊藻共培养10 d时溶藻率达80%，对有害丝状蓝藻席藻和水华鱼腥藻亦均有较强的溶藻作用，溶藻率大于99%；梁锏文等 ［ 41 41 ］ 分离的放线菌L74发酵液以10%（体积分数）比例共培养6 d时对鱼腥藻、颤藻和束丝藻的溶藻效率为71%~85%。这些放线菌产生的溶藻物质对水华蓝藻均具有较好的溶藻效率，具有作为天然杀藻剂的潜力，值得深入系统研究。 4　 结 语 1 本研究筛选获得一株具有高效广谱溶藻效果的放线菌LW9，经形态及分子生物学初步鉴定为菲律宾链霉菌（ Streptomyces filipinesis ）。放线菌LW9主要通过分泌胞外活性物质溶藻，该物质主要在生长稳定期积累，且在高温、酸性和碱性环境以及紫外光照射下均具有较高稳定性。放线菌LW9不仅对最常见铜绿微囊藻具有较强溶藻效果，对丝状水华蓝藻包括柔细束丝藻以及颤藻也具有明显的溶藻效果，可作为开发微生物控藻菌剂的候选菌株。利用溶藻微生物分离筛选高效、专一、环境友好的溶藻活性代谢产物，开发新型溶藻制剂治理藻类水华，是当前控藻的新思路。但从实验室内走向野外应用还有大量基础工作要开展，例如优化放线菌的发酵条件，提高单位体积的菌量以及活性产物的含量；对菌株进行生态安全性评估；考察不同菌株投放形式、投放时间与投放剂量的溶藻效果。此外，溶藻菌对水华蓝藻的裂解作用会促进蓝藻毒素的释放，因此在实际应用中，探索蓝藻水华控制与蓝藻毒素去除有机整合的技术才能达到环境、生态和健康效应三者的平衡，这也是我们后期工作的重点。 参考文献 HO J C ， MICHALAK A M ， PAHLEVAN N . 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