上转换荧光纳米颗粒耦合FAM染料高效检测CA125

上转换荧光纳米颗粒耦合FAM染料高效检测CA125 Upconversion Fluorescent Nanoparticles Coupled with FAM for Highly Efficient Assaying CA125 first-author 张肖静，女，硕士生，现从事稀土上转换荧光纳米探针的研究。E-mail：zxj1993analy@163.com 张肖静，女，硕士生，现从事稀土上转换荧光纳米探针的研究。E-mail：zxj1993analy@163.com zxj1993analy@163.com corresp E-mail： lichychem@mail.scuec.edu.cn E-mail： lichychem@mail.scuec.edu.cn lichychem@mail.scuec.edu.cn 中南民族大学 化学与材料科学学院/国家民委分析化学重点实验室，湖北 武汉 430074 中南民族大学 化学与材料科学学院/国家民委分析化学重点实验室，湖北 武汉 430074 College of Chemistry and Materials Science， South-Central University for Nationalities/Key Laboratory of Analytical Chemistry of the State Ethnic Affairs Commission， Wuhan 430074， Hubei， China College of Chemistry and Materials Science， South-Central University for Nationalities/Key Laboratory of Analytical Chemistry of the State Ethnic Affairs Commission， Wuhan 430074， Hubei， China 以上转换荧光纳米颗粒（UCNPs）为能量供体、有机染料羧基荧光素（FAM）为能量受体，基于分子信标模型构建检测卵巢癌标志物CA125的荧光分析体系。UCNPs与FAM分别标记于发卡型DNA分子两端，两者间经荧光共振能量转移（FRET）引起UCNPs上转换荧光猝灭，猝灭效率可达83%。CA125与DNA的适配体序列特异性结合后，打开其发卡结构，使UCNPs与FAM的距离增大，抑制FRET过程，导致上转换荧光增强。上转换荧光强度与CA125浓度的对数具有良好的线性关系，线性范围为0.02~100 U/mL，检出限为0.017 U/mL。该荧光分析系统具有良好的选择性及稳定性，可成功用于人血清中CA125定量检测，有望成为卵巢癌早期诊断的有力工具。 CA125 is a common biomarker for early diagnosis of ovarian cancer. Herein, a molecular beacon sensor for CA125 detection was fabricated based on fluorescent resonance energy transfer（FRET）strategy, in which UCNPs （upconversion nanoparticles）and FAM were employed as energy donor and energy acceptor, respectively. The two components were linked by a hairpin DNA containing CA125 aptamer sequence. The upconversion luminescence（UCL）of UCNPs was quenched with a degree of 83% in an effective FRET process. The strong interaction between CA125 and the aptamer sequence broke the hairpin structure, resulting in the prohibition of FRET and recovery of UCL. The UCL intensity increased linearly with the logarithm of CA125 concentration in the range of 0.02-100 U/mL, with a detection limit of 0.017 U/mL. The fluorescence system possesses excellent sensitivity, selectivity and stability, and can be successfully applied for determining CA125 in human serum, thus shows promising applications for early diagnosis of ovarian cancer. 上转换纳米颗粒 羧基荧光素 荧光共振能量转移 CA125 早期诊断 upconversion nanoparticles carboxyfluorescein fluorescent resonance energy transfer CA125 early diagnosis 0　 引 言 1 恶性肿瘤（癌症）具有细胞无限增值、易转移等特点，是致死率较高的重大疾病。其中，卵巢癌是致死率较高的妇科恶性肿瘤 ［ 1 1 ］ 。目前，卵巢癌患者多在肿瘤发展晚期才得以确诊，确诊后患者存活时间超过5年的比例不到50% ［ 2 2 ］ 。早期确诊可使该比例提升到90% ［ 3 3 ］ ，是提高其治愈率的重要手段。因此，开发卵巢癌早期诊断策略具有重要意义。CA125是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的卵巢癌标志物，其浓度与卵巢癌的发生、发展密切相关。80%以上卵巢癌患者血清中CA125浓度偏高（正常人一般低于35 U/mL），是卵巢癌早期诊断的重要依据。目前，已经发展了多种CA125分析方法，例如酶联免疫吸附测定（ELISA） ［ 4 4 ］ ，光电免疫分析 ［ 5 5 ， 6 6 ］ ，微流控芯片电泳 ［ 7 7 ］ 等。但是这些方法存在检测步骤繁琐、灵敏度低等缺点，限制了其在实际样品检测分析中的应用。 基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）策略的荧光探针是一种操作简单的均相荧光分析技术，检测过程不需样品预处理，可直接进行血清内生物组分的定量分析 ［ 8 8 ~ 14 14 8~14 ］ 。待测目标物与探针反应后抑制或促进FRET过程引起探针荧光信号增强或减弱，进而可根据荧光强度变化计算出目标物浓度。其中，荧光增强型FRET探针具有更高的灵敏度，用于CA125分析将具有重要价值 ［ 15 15 ］ 。然而，常用FRET荧光分析体系多采用可见光激发的荧光材料为能量供体。在可见光激发下，生物样品会产生较强的自发荧光，对检测结果带来显著干扰 ［ 16 16 ］ 。镧系元素掺杂上转换纳米粒子（UCNPs）可以连续吸收两个或多个近红外光子，发射反-Stokes荧光（即上转换荧光） ［ 17 17 ~ 22 22 17~22 ］ 。由于其激发光位于近红外区域，可有效避免来自生物样品自发荧光的干扰，在生物分析领域具有独特的优势 ［ 23 23 ~ 29 29 23~29 ］ 。 综上所述，基于上转换荧光共振能量转移（UC-FRET）机理，采用分子信标模型，构建荧光增强型CA125荧光分析系统。CA125探针FAM-Apt-UCNPs的构建及响应机理示意图（ 图1 图1 ）显示，探针由UCNPs、有机染料羧基荧光素（FAM）以及发卡型DNA（Apt）三部分组成。UCNPs发射光谱与FAM吸收光谱匹配，可分别充当FRET过程的能量供体和能量受体；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求，此时UCNPs的上转换荧光被FAM猝灭。当CA125存在时，CA125与适配体序列结合，迫使DNA的发卡结构打开，构型变化增大了UCNPs与FAM的距离，进而抑制FRET作用，引起UCNPs的上转换荧光增强。该探针具有良好的选择性与稳定性，不仅适用于缓冲溶液中CA125的分析检测，还可用于人血清样品中的CA125定量分析，有望成为卵巢癌早期诊断的有效工具。 1　 实验部分 1 1.1　仪器与试剂 2 主要仪器：980 nm P2型可调半导体激光器一体化光源（海特光电有限责任公司）；FT-IR红外光谱仪（尼高力公司）；TGL-16M型高速冷冻离心机（上海卢湘仪器离心仪器有限公司）；UV-Vis分光光度计（岛津公司）；Tecnai G 2 20 ST透射电子显微镜（FEI公司）；F-7000荧光分光光度计（日立公司）；THZ-C台式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）。 主要试剂：氧化钇、氧化铒、氧化镱、氟化钠、油酸（OA）、1-十八烯（ODE）购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；聚丙烯酸（PAA）、 N -羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸（EDC·HCl）购于Sigma-Aldrich公司；免疫球蛋白（IgG）、癌胚抗原（CEA）、人附睾蛋白4（HE4）、甲胎蛋白（AFP）、CA125购于上海领潮生物科技有限公司；NH 2 -Apt-FAM（FAM-AACAAC CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCT CAAAGGTTG-NH 2 ）购于生工生物工程有限公司；正常人及卵巢癌患者血清由湖北省人民医院提供；文中所用水均为超纯水，检测所用缓冲液均为HEPES水溶液（10 mmol/L， pH 7.4， NaCl， 0.15 mol/L）。 1.2　合成方法 2 1.2.1　稀土油酸盐(Ln(oleate) 3 )的合成 3 将稀土金属氧化物Y 2 O 3 、Yb 2 O 3 、Tm 2 O 3 （2.5 mmol）以物质的量79.8∶20∶0.2的比例加入到单口瓶中，滴入适量盐酸，加热至溶液澄清。蒸馏除去溶剂，得到稀土盐酸盐。加入7.5 mL超纯水、10 mL乙醇、17.5 mL正己烷，70 ℃加热5 h，待冷却至室温后萃取3次，旋转蒸发除去溶剂，所得产物溶于体积比1∶1的油酸和1-十八烯的溶剂中，得到稀土油酸盐（Ln（oleate） 3 ）。 1.2.2　OA包覆的UCNPs (OA-UCNPs)的合成 3 将1 mmol Ln（oleate） 3 （稀土离子摩尔比 n （Y 3+ ）∶ n （Yb 3+ ）∶ n （Tm 3+ ）=79.8∶20∶0.2）、20 mmol NaF、6 mL OA和6 mL ODE依次加入三口烧瓶，在氩气氛围下将温度升高至50 ℃，加热搅拌1 h，以除去混合物中的水和氧气。升温至320 ℃，继续搅拌2 h，随后将混合物在240 ℃退火1 h，以减少纳米颗粒表面的缺陷，增强上转换发光效率。冷却至室温后，用12 000 r/min转速离心，收集得到的纳米颗粒，用己烷洗涤3次，将得到的OA-UCNPs分散在环己烷中备用。 1.2.3　PAA包覆的UCNPs (PAA-UCNPs)的合成 3 向装有100 mg OA-UCNPs的单口瓶中加入50 mL乙醇，用浓盐酸调节pH值至1.0，超声振荡3 h，去除纳米颗粒表面修饰的油酸配体。离心后收集沉淀，依次用乙醇、水洗涤，得到表面无配体修饰的UCNPs。将所得UCNPs加入到含有50 nmol PAA的10 mL超纯水中，室温下搅拌12 h，离心水洗，收集并提纯，得PAA-UCNPs，分散在超纯水中，4 ℃储存。 1.2.4　CA125探针FAM-Apt-UCNPs的制备 3 以EDC·HCl和Sulfo-NHS为交联剂进行NH 2 -Apt-FAM和PAA-UCNPs的共价偶连。具体步骤为：将100 μL 10 mg/mL PAA-UCNPs、0.2 mg EDC·HCl和0.6 mg Sulfo-NHS依次加入到700 μL MES缓冲溶液（10 mmol/L，pH 5.5）中，37 °C摇动1 h以活化PAA-UCNPs表面的羧基。离心收集活化的纳米颗粒，分散于含有1 nmol CA125适配体的1 mL HEPES缓冲溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中。37 o C孵育12 h后，将10 mg Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS。离心收集沉淀，用水洗涤3次。最后将得到的FAM-Apt-UCNPs分散于1 mL HEPES缓冲溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中，4 o C保存。 1.3　缓冲溶液中CA125的检测 2 将探针及不同浓度的CA125加入到2 mL离心管，控制探针终浓度均为0.05 mg/mL，37 °C孵育100 min。以980 nm连续激光器作为光源（功率1 W），测量410~550 nm范围的上转换荧光光谱，每组平行检测3次。 1.4　探针选择性的测试 2 向0.05 mg/mL探针的HEPES溶液中分别加入牛血清蛋白（BSA）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、谷胱甘肽（GSH）、免疫球蛋白G（IgG）、人表皮蛋白4（HE4）、半胱氨酸（Cys）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）各100 μg/mL，CA19-9和CA125各100 U/mL，37 °C孵育100 min后测量上转换荧光光谱，每组平行检测3次。 1.5　正常人血清中CA125的检测 2 将正常人血清用HEPES缓冲稀释100倍后，取相同体积加至2 mL离心管中，加入探针（终浓度均为0.05 mg/mL）及不同浓度的CA125，37 o C孵育100 min后，测量溶液的上转换荧光光谱，每组平行检测3次。 1.6　卵巢癌患者血清中CA125的检测 2 向探针的HEPES溶液中加入稀释100倍的卵巢癌患者血清，37 °C孵育100 min后，测量溶液的上转换荧光。加标回收试验：向探针的HEPES溶液中同时加入稀释100倍的患者血清及CA125标准溶液，37 °C孵育100 min后，测量其上转换荧光光谱，每组平行检测3次。 2　 结果与讨论 1 2.1　OA-UCNP的表征 2 图2 图2 A为OA-UCNPs的透射电子显微镜（TEM）图，显示所制备的OA-UCNPs样品为形貌均一的球形，直径约41 nm。 图2 图2 B为OA-UCNPs的X射线衍射（XRD）谱图，其谱图与标准六方相NaFY 4 晶体（ β -NaYF 4 -16-0334）一致，表明其晶相为六方相。六方相是上转换荧光纳米颗粒发光效率最高的晶相 ［ 30 30 ］ ，可保证探针具有足够的上转换荧光强度。 2.2　PAA-UCNP制备过程的表征 2 OA-UCNPs不具备水相中分散能力，且缺乏与DNA耦联的活性基团，故需对所合成OA-UCNPs进行表面配体交换。PAA的羧基可经酰胺化反应与DNA等生物分子耦联，且具有良好的水溶性，采用PAA替换OA-UCNPs表面的油酸分子可同时解决上述问题。PAA-UCNPs的制备分为两步： 1） 在盐酸的乙醇溶液中超声去除UCNPs表面油酸配体；2） 利用羧基与表面稀土离子间的配位作用在UCNPs表面包覆PAA。通过Fourier变换红外光谱（FT-IR）表征PAA-UCNPs的制备过程。如 图3 图3 所示，未修饰UCNPs的FT-IR谱图中，归属于油酸分子的=C—H基团伸缩振动峰（740 cm -1 ）和COO - 伸缩振动峰（1 565 cm -1 ）消失，表明油酸配体已成功移除；PAA-UCNPs的FT-IR谱图中出现COO - 基团的伸缩振动峰（1 565 cm -1 ） 和C=O伸缩振动（1 709 cm -1 ），证明PAA-UCNPs成功制备。 2.3　FAM-Apt-UCNPs探针的表征 2 FAM-Apt-UCNPs探针是基于UCNPs到能量受体之间的FRET过程构建，而FRET发生需要满足两个基本条件 ［ 28 28 ］ ：1） 能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱匹配；2） 能量供体与能量受体的距离接近（ < 10 nm）。故选取光物理性质匹配的能量受体是需要考虑的重要因素之一。 图4 图4 显示，FAM的吸收峰位于488 nm，其紫外-可见吸收光谱与UCNPs的发射光谱匹配，是优良的能量受体。 利用PAA-UCNPs表面—COOH与FAM-Apt-NH 2 末端—NH 2 之间的酰胺化反应，可实现两者间耦联。 图5 图5 A 显示，FAM-Apt-UCNPs的紫外-可见吸收光谱在260 nm及488 nm处存在两个明显的吸收峰，分别对应于FAM-Apt-NH 2 中的DNA链与FAM的吸收，证明探针耦联成功。FAM-Apt-NH 2 的发卡结构拉近UCNPs与FAM的距离，促使FRET过程发生。由 图5 图5 B可知，PAA-UCNPs与FAM-Apt-NH 2 连接后，上转换荧光强度显著降低，根据 公式（1） 公式（1） ［ 31 31 ］ 可以计算出其猝灭效率QE高达83%。 QE= <math display="block" id="M1"><mfrac><mrow><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">A</mi><mi mathvariant="normal">A</mi><mo>-</mo><mi mathvariant="normal">U</mi><mi mathvariant="normal">C</mi><mi mathvariant="normal">N</mi><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">s</mi></mrow></msub><mo>-</mo><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">F</mi><mi mathvariant="normal">A</mi><mi mathvariant="normal">M</mi><mo>-</mo><mi mathvariant="normal">A</mi><mi mathvariant="normal">p</mi><mi mathvariant="normal">t</mi><mo>-</mo><mi mathvariant="normal">U</mi><mi mathvariant="normal">C</mi><mi mathvariant="normal">N</mi><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">s</mi></mrow></msub></mrow><mrow><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">A</mi><mi mathvariant="normal">A</mi><mo>-</mo><mi mathvariant="normal">U</mi><mi mathvariant="normal">C</mi><mi mathvariant="normal">N</mi><mi mathvariant="normal">P</mi><mi mathvariant="normal">s</mi></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn mathvariant="normal">100</mn><mi mathvariant="normal">%</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=11297504&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=11297500&type= 53.59399796 8.46666718 其中， F PAA-UCNPs 与 F FAM-Apt-UCNPs 分别代表PAA-UCNPs与FAM-Apt-UCNPs在峰值478 nm处的上转换荧光强度。 2.4　溶液中探针响应性能测试 2 CA125与适配体结合迫使DNA的发卡结构打开，增大了UCNPs与FAM的距离，从而抑制FRET过程，由此导致UCNPs的上转换荧光恢复。为确保探针与CA125完全反应，首先进行了反应动力学测试。如 图6 图6 所示，当存在CA125时，探针上转换荧光强度随时间延长而增强，并在100 min左右到达平台，证明在100 min以内反应完全。因此，后续检测的孵育时间均选用100 min。 优化孵育时间后，对探针进行荧光滴定测试。随着CA125浓度增大，探针上转换荧光强度逐步增强（ 图7 图7 A），且上转换荧光强度与CA125浓度的对数lg c 具有良好的线性关系（ 图7 图7 B），其线性范围为0.02~100 U/mL，对应关系为（ F-F 0 ）/ F 0 =1.74lg c +3.18 （ R 2 =0.998），检出限达0.017 U/mL。其中， F 和 F 0 分别表示CA125不同浓度和不存在时探针在478 nm处的上转换荧光强度。 为排除探针自身上转换荧光强度改变对检测结果的干扰，考察了探针的热力学稳定性。如 图8 图8 A所示，探针在37 ℃孵育100 min内上转换荧光强度基本不变，表明该探针具有良好的热力学稳定性，可进一步说明探针上转换荧光强度增强源于其与CA125的识别反应。对探针进行选择性测试：在相同条件将探针分别与CA125及各种干扰物进行孵育，测试其上转换荧光强度的变化。从 图8 图8 B可知，仅CA125能引起探针上转换荧光强度的显著增强，说明该探针具有优良的选择性，满足复杂生物样品中CA125定量检测的要求。 2.5　人血清中探针的响应性能 2 基于FAM-Apt-UCNPs探针在缓冲溶液中优异的检测性能，将其应用于复杂生物样品中CA125分析。将正常人血清稀释100倍作为分析介质，以FAM-Apt-UCNPs探针分析其中CA125的含量。如 图9 图9 A所示，随着CA125浓度的增加，体系的上转换荧光强度逐渐增强。在0.02~100.00 U/mL的浓度范围内，探针的上转换荧光强度与CA125的浓度对数具有线性关系（ 图9 图9 B），线性方程为：（ F-F 0 ）/ F 0 =1.73lg c +3.17（ R 2 =0.998）。该探针在人血清样品中的响应性能与溶液中的响应性能相似，表明该探针适用于人血清样品中CA125的检测。 在此基础上，将FAM-Apt-UCNPs探针用于实际卵巢癌患者血清样品中CA125浓度的测定。利用血清中探针的上转换荧光强度和CA125浓度间的关系，可计算出3位卵巢癌患者血清稀释100倍后CA125浓度分别为1.51、1.58、2.50 U/mL（即稀释前血清中CA125浓度分别为151、158、250 U/mL），与临床检测结果相近（ 表1 表1 ）。通过加标回收实验进一步验证检测结果的准确性，回收率为101%~102%，相对标准偏差（RSD）为3.5%~5.0%，表明该荧光体系用于实际血清样品中CA125的分析具有很好的准确性。3位患者血清中CA125含量均大于临界浓度35 U/mL，与卵巢癌患者血清中CA125的浓度水平相符，可为卵巢癌早期诊断提供重要依据。 Samples Measured/(U/mL) Added/(U/mL) Found/(U/mL) Recovery/% RSD/% 1 1.51 2.0 6.16 101 5.0 2 1.58 1.5 3.58 101 3.5 3 2.50 2.5 5.08 102 3.5 3　 结 语 1 本研究以可被近红外光激发的UCNPs为能量供体、有机染料FAM为能量受体，基于FRET原理构建可用于CA125高效分析的上转换荧光系统。UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，两者之间的FRET作用引起UCNPs的上转换荧光猝灭，CA125与适配体序列的特异性识别可以打开DNA的发卡结构，抑制FRET过程并恢复UCNPs的上转换荧光。该探针具有较高的灵敏度及选择性，其检出限可达0.017 U/mL，且可有效避免各种生物组分的干扰，实现对临床人血清样品中CA125的准确分析。利用该探针对卵巢癌患者的血清样品进行检测，其中的CA125含量均大于临界浓度35 U/mL，表明该荧光分析体系有望为卵巢癌早期诊断提供有效手段。 参考文献 WALL J A ， AREND R C . 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