次氯酸根激活的线粒体靶向上转换荧光纳米探针的构建

次氯酸根激活的线粒体靶向上转换荧光纳米探针的构建 Construction of Hypochlorite-Activatable and Mitochondrion-Targeting Upconversion Fluorescent Nanoprobe first-author 李 贞，女，博士，现从事稀土发光纳米材料及其生物应用研究。E-mail：zhenli@whu.edu.cn 李 贞，女，博士，现从事稀土发光纳米材料及其生物应用研究。E-mail：zhenli@whu.edu.cn zhenli@whu.edu.cn corresp E-mail： zhhliu@whu.edu.cn E-mail： zhhliu@whu.edu.cn zhhliu@whu.edu.cn 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China 线粒体内次氯酸根（ClO - ）的异常表达会导致其机能障碍，进而诱导细胞凋亡。基于此，设计合成了一种咔唑-半花菁类小分子有机染料Caz-Hcy作为夹层结构上转换纳米颗粒（SWUCNPs）的能量受体，构建了基于上转换荧光共振能量转移（UC-FRET）的上转换荧光纳米探针。该探针对ClO - 响应速度快，且灵敏度高（检出限0.55 μmol/L）、选择性好，同时，Caz-Hcy结构中带有正电荷的氮杂环部分还具有靶向线粒体的能力。通过ClO - 调控Caz-Hcy的吸收光谱性质来调控探针的能量转移效率，能够实现对线粒体中ClO - 含量变化的分析检测。 The abnormal concentration of hypochlorite (ClO - ) in mitochondria can cause mitochondrial dysfunction, and further lead to apoptosis of cells. Herein, a Caz-Hcy dye was designed to act as the energy acceptor of sandwich-structured upconversion nanoparticles (SWUCNPs) to construct a UC-FRET (upconversion-fluorescence resonance energy transfer) nanoprobe for detection of mitochondrial ClO - . This nanoprobe can respond to ClO - with high speed, superior sensitivity (limit of detection: 0.55 μmol/L) and excellent selectivity. In addition, the nanoprobe can target mitochondria because of the positively charged nitrogen heterocyclic moiety in Caz-Hcy. ClO - is able to shift the dye’s absorption spectrum and regulate the energy transfer efficiency from SWUCNPs to Caz-Hcy, detecting the concentration of ClO - . 上转换荧光探针 荧光共振能量转移 次氯酸 线粒体 生物成像 upconversion nanoprobe fluorescence resonance energy transfer hypochlorite (ClO - ) mitochondrion bio-imaging 0　 引 言 1 次氯酸根（hypochlorite，ClO - ）是一种常见的饮用水杀菌剂，且常以浓缩形式作为日常的家用漂白剂 ［ 1 1 ］ 。ClO - 在生物体内生理过程和病理过程中也发挥着重要作用 ［ 2 2 ］ ，其在生物体内由绿过氧化物酶催化过氧化氢和氯离子反应生成 ［ 3 3 ］ ，可参与组织修复，其杀菌活性在生物体防御系统中具有重要意义 ［ 4 4 ］ 。但相关研究也表明，生物体内异常表达的ClO - 也和多种疾病相关，如阿尔兹海默症 ［ 5 5 ］ 、心血管疾病 ［ 6 6 ， 7 7 ］ 、动脉粥样硬化 ［ 8 8 ］ 、神经元变性 ［ 9 9 ］ 、肺部损伤 ［ 10 10 ］ 以及一些癌症等 ［ 11 11 ］ 。线粒体是生物体内活性氧产生的主要场所 ［ 12 12 ］ ，线粒体内ClO - 与线粒体氧化还原平衡及维持线粒体正常功能密切相关 ［ 13 13 ］ 。线粒体中异常表达的ClO - 会引起线粒体失活，并进一步诱导细胞凋亡。线粒体机能障碍是导致大多数疾病的关键因素。因此，发展检测线粒体内ClO - 的有效方法对于探究其在疾病过程中的作用机制具有重要意义。 近年来，荧光分析法由于其非侵入性、实时、可视化等特点，被认为是生物医学分析最有利的手段之一。构建高性能荧光探针是实现荧光分析的关键 ［ 14 14 ， 15 15 ］ 。目前，已报道了大量可应用于检测细胞内ClO - 的荧光探针。但该类探针大多基于有机小分子荧光探针，存在一个固有缺陷，即易发生光漂白。上转换荧光纳米颗粒（upconversion fluorescent nanoparticles， UCNPs）是一类稀土离子掺杂的反-Stokes发光材料，能够连续吸收两个或两个以上低能量光子（波长在近红外光区），发射出高能量的紫外-可见光 ［ 16 16 ， 17 17 ］ 。由于其近红外光激发的特性，UCNPs在生物分析领域具有显著优势：1） 显著提高组织内光穿透深度；2） 消除来自生物样本的散射光和自发荧光的干扰；3） 减小对生物样本的光损伤 ［ 18 18 ， 19 19 ］ 。除此之外，UCNPs具有优异的光稳定性 ［ 20 20 ］ 。近几年涌现了一批上转换荧光探针，其分析目标物则涵盖了离子、小分子以及DNA、蛋白等生物大分子 ［ 21 21 ~ 25 25 21~25 ］ 。 基于上述研究，本文设计了一种咔唑-半花菁类小分子染料Caz-Hcy作为夹层结构UCNPs（SWUCNPs）的能量受体，构建了基于上转换荧光共振能量转移（UC-FRET）原理的上转换荧光探针。本课题组之前的研究发现 ［ 26 26 ］ ，SWUCNPs的发光离子分布在纳米颗粒表面附近的一层薄壳内，处于发生能量转移的有效距离中，因此具有较高的能量转移效率，从而提高探针的信背比及检测灵敏度。当体系中存在ClO - 时，Caz-Hcy的共轭结构被破坏，吸收光谱发生位移，能量转移过程受到抑制。Caz-Hcy不仅具有特异性识别ClO - 的能力，其带有正电荷的氮杂环结构可以靶向结合线粒体，从而实现对线粒体中ClO - 的分析检测。 1　 实验部分 1 1.1　仪器和试剂 2 仪器：980 nm半导体近红外激光器（北京海特尔光电有限责任公司），RF5301型荧光光谱仪（岛津公司），UV-2550型紫外/可见分光光度计（Shimadzu公司），NICOLET 5700型红外光谱仪（Thermo Electron公司），JEM-2010型透射电子显微镜（JEOL公司），D8型X射线粉晶衍射仪（Bruker公司），ZS ZEN3600型激光粒度分析仪（马尔文仪器有限公司），Multiskan FC型酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司），Nikon Ni-E Microscope型荧光成像系统（Nikon公司）。 试剂：Y 2 O 3 、Gd 2 O 3 、Yb 2 O 3 、Tm 2 O 3 、PMA（佛波醇肉豆蔻酸酯）、NAC（ N -乙酰半胱氨酸）购自上海阿拉丁技术有限公司，其余试剂均购于上海国药集团，所有试剂均为分析纯或更高纯度，使用前无需进一步纯化；实验所需溶液均使用高纯水配制。 1.2　实验步骤 2 1.2.1　能量受体Caz-Hcy的合成 3 Caz-Hcy合成路线如 图1 图1 所示。 化合物 1 与化合物 2 参照文献方法合成 ［ 27 27 ， 28 28 ］ 。 化合物 3 的合成。将0.66 mL（8.9 mmol）DMF（二甲基甲酰胺）置于冰浴中，向其中滴加三氯氧磷（0.82 mL，8.9 mmol），至体系发生凝固时加入二氯甲烷（20 mL）溶解，并搅拌30 min。随后，加入化合物 2 （1.5 g，5.9 mmol），于70 ℃条件下搅拌反应过夜，除去溶剂，加入饱和NaHCO 3 溶液，以乙酸乙酯萃取，收集有机相，并用无水Na 2 SO 4 干燥。过滤，旋蒸除去溶剂。利用柱层析对产物进行分离纯化，以乙酸乙酯/石油醚（体积比1∶2）为淋洗剂。旋蒸、干燥，得到浅黄色的化合物 3 （1.2 g，产率72.4%）。磁共振氢谱（ 1 H NMR，400 MHz，CDCl 3 ）化学位移数据：10.08（s，1H），8.57（d， J =1.2 Hz， 1H），8.16~8.09（m，1H），7.99（dd， J =8.5，1.6 Hz， 1H），7.52（ddd， J =8.3，7.2，1.2 Hz，1H），7.41~7.31（m，3H），5.00（s，2H），4.21（q， J =7.1 Hz，2H），1.23（t， J =7.1 Hz，3H）。 化合物 4 的合成。将10 mL 二甲基亚砜（DMSO）与5 mL H 2 O混合，并溶解400 mg（1.4 mmol）化合物 3 ，10 mmol（400 mg）NaOH溶液中缓慢滴加入到化合物 3 溶液中，室温搅拌反应1 h后，加入100 mL H 2 O稀释，并用稀盐酸进行酸化处理，观察到产生大量沉淀。过滤，取滤渣真空干燥，得到淡黄色固体化合物 4 （320 mg，产率89.0%）。 1 H NMR（400 MHz，DMSO）化学位移数据： 13.21（s，1H），10.09（s，1H），8.79（s，1H），8.32（d， J =7.7 Hz，1H），8.00（dd， J =8.5，1.3 Hz，1H），7.77（d， J =8.5 Hz，1H），7.67（d， J =8.2 Hz，1H），7.54（t， J =7.7 Hz，1H），7.34（t， J =7.4 Hz，1H），5.36（s，2H）。 化合物 5 的合成。将10 mL DMF置于冰浴中，加入化合物 4 （400 mg，1.6 mmol）、EDCI（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，374 mg，1.9 mmol）、HOBt（1-羟基苯并三唑，253.3 mg，1.9 mmol）溶解后搅拌反应30 min。向体系中加入亚氨基二乙酸二乙酯（290 mg，1.6 mmol），室温搅拌反应过夜。随后，将体系倒入大量水中，并用乙酸乙酯进行萃取，饱和食盐水洗涤有机相3次，饱和NaHCO 3 溶液洗涤3次。利用无水Na 2 SO 4 干燥有机相，除去溶剂，用柱层析对所得固体进行分离纯化（淋洗剂为乙酸乙酯/石油醚（体积比1∶1）），干燥后可得浅黄色化合物 5 （300 mg，产率57.7%）。 1 H NMR（400 MHz， CDCl 3 ）化学位移数据： 10.08（s，1H），8.59（d， J =1.4 Hz，1H），8.13（d， J =7.7 Hz，1H），7.99（dd， J =8.5，1.5 Hz，1H），7.55~7.48（m，1H），7.43~7.29（m，3H），5.16（s，2H），4.28（s，2H），4.27~ 4.14（m，6H），1.31（t， J =7.2 Hz，3H），1.25（dd， J =8.8，5.5 Hz，4H）。 化合物 6 的合成。取400 mg化合物 5 溶解于DMSO（二甲基亚砜，20 mL）中，将10 mL NaOH溶液（400 mg，10 mmol）缓慢滴加入体系中，搅拌1 h后，加入50 mL水并利用乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水洗涤有机相3次，除去溶剂，得到化合物 6 （320 mg，产率92.2%）。 1 H NMR（400 MHz，DMSO）化学位移数据： 10.07（s，1H），8.77（d， J =1.3 Hz，1H），8.30（d， J =7.7 Hz，1H），7.98（dd， J =8.6，1.5 Hz，1H），7.57（d， J =8.6 Hz，1H），7.54~7.45（m，2H），7.32（ddd， J =7.9，6.4，1.7 Hz，1H），5.46（s，2H），4.50（s，2H），4.04（s，2H）。 Caz-Hcy的合成。取150 mg化合物 6 与150 mg化合物 1 溶解于甲醇（20 mL）中，充入氩气保护，回流反应过夜。随后，加入大量乙醚，产生沉淀，过滤收集沉淀，并用少量饱和NaHCO 3 溶液溶解沉淀，再加入盐酸产生沉淀，离心收集沉淀。将得到的沉淀重复上述步骤3次，并利用柱层析纯化分离，干燥。最后得到粉红色固体Caz-Hcy（产率17.5%）。 1 H NMR（400 MHz，DMSO）化学位移数据： 13.22（s，2H），9.16（s，1H），8.65（d， J =16.1 Hz，1H），8.41~8.34（m，1H），8.26（d， J =7.8 Hz，1H），7.90~7.83（m，2H），7.75（d， J =16.1 Hz，1H），7.66~7.57（m，3H），7.52（dd， J =11.1，4.6 Hz，2H），7.36（ddd， J =7.9，6.5，1.7 Hz，1H），5.47（s，2H），4.47（s，2H），4.17（s，3H），4.03（s，2H），1.85（s，6H）。 1.2.2　能量供体SWUCNPs的合成 3 SWUCNPs参照之前文献中步骤 ［ 25 25 ］ ，以晶种生长法进行合成。具体步骤如下：将Ln（oleate） 3 （1 mmol，Ln：Y/Gd（摩尔比80∶20））、10 mL油酸（OA）和10 mL 1-十八烯（ODE）加入到100 mL三口烧瓶中，再加入20 mmol NaF。将体系在110 ℃条件下抽真空1 h除水除氧。随后充氮气保护，并升温至320 ℃，反应75 min。之后，取出4 mL反应液，向其中加入8 mL含0.4 mmol Ln（oleate） 3 （Ln：Y/Yb/Tm（摩尔比79.8∶20∶0.2）的溶剂（OA/ODE（体积比1∶1）），继续在320 ℃反应20 min。随后，取出6 mL反应液，再向反应体系中加入8 mL含0.4 mmol Y（oleate） 3 的溶剂（OA/ODE（体积比1∶1）），继续在320 ℃反应20 min后将体系冷却至室温。在反应体系中加入等体积的乙醇使所得纳米颗粒沉淀，利用正己烷/乙醇（体积比1∶1）的混合溶液洗涤沉淀6次，最后将所得SWUCNPs分散于正己烷中保存。 1.2.3　探针Caz-Hcy-SWUCNPs的构建 3 取60 mg SWUCNPs加入到30 mL pH 1.0的盐酸乙醇溶液中，超声1 h将SWUCNPs表面的OA配体除去，离心收集SWUNPs，并用pH 4.0的盐酸乙醇溶液洗涤SWUCNPs 1次，进行纯化。用水和乙醇分别洗涤SWUCNPs 3次，所得终产物分散于高纯水中备用。将 1 mg SWUCNPs分散于1 mL MOPS（3-（ N -吗啉基）丙磺酸）缓冲溶液中（10 mmol/L，pH 7.2，100 mmol/L KCl），加入0~800 μmol/L Caz-Hcy溶液，37 ℃孵育过夜，离心除去多余的Caz-Hcy，所得沉淀用水洗涤3次，并最终分散于水中（浓度为1 mg/mL）得到Caz-Hcy-SWUCNPs探针。 1.2.4　细胞毒性检测 3 取HeLa细胞接种于96孔板中，以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基在37 ℃和5% CO 2 条件下培养12 h后，加入分散于培养基中的Caz-Hcy-SWUCNPs探针（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL），每个浓度平行做3组，继续培养12 h。随后，将细胞用PBS（磷酸盐缓冲溶液）洗涤3次，加入0.5 mg/mL MTT试剂，37 ℃孵育4 h，加入150 μL DMSO溶解形成的甲臜晶体，用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度。细胞存活率（%）由以下公式计算： 细胞存活率=（实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。 1.2.5　细胞荧光共定位成像 3 将HeLa细胞接种于玻底培养皿中，培养2 d，加入Caz-Hcy-SWUCNPs（0.3 mg/mL，分散于无血清的DMEM培养基中）培养10 h，加入PMA刺激细胞1.5 h后，加入商品化线粒体定位染料MitoTracker Red CMXRos，15 min后利用共聚焦荧光显微镜对细胞进行荧光共定位成像。 1.2.6　细胞线粒体中ClO - 成像 3 将HeLa细胞接种于玻底培养皿中，培养2 d，将培养基更换为Opti-MEM培养基。加入Caz-Hcy-SWUCNPs（0.3 mg/mL，分散于Opti-MEM培养基中）培养10 h后进行细胞成像。正对照组：孵育探针后，加入PMA刺激细胞1.5 h后进行成像。另一组对照实验：加入PMA前，先加入10 mmol/L活性氧清除剂NAC孵育30 min，随后进行与正对照组相同操作，以进一步确定观察到的荧光信号变化是否由ClO - 引起。 2　 结果与讨论 1 2.1　Caz-Hcy-SWUCNPs探针的设计原理 2 半花菁染料是一类应用广泛的有机染料，其吸收波长在较宽范围内可灵活调节，且其结构中的氮杂环部分作为脂溶性阳离子，能够使其富集在线粒体中，从而可应用于构建线粒体靶向的荧光探针。基于此，本文以一种半花菁衍生物为SWUCNPs的能量受体，构建了基于UC-FRET原理的上转换纳米探针用于检测线粒体中的ClO - 。在之前的报道 ［ 26 26 ］ 中，设计了一种发光离子分布在纳米颗粒表面的SWUCNPs，以其为能量供体，能够显著提高探针的能量转移效率，从而提高探针的检测灵敏度。本研究中以咔唑-半花菁染料Caz-Hcy作为能量受体，其在466 nm波长处有强吸收带，与SWUCNPs的发射光谱有效重叠，而其分子结构中的羧基可与SWUCNPs表面裸露的稀土离子发生配位作用实现能量供受体的组装，从而构建纳米探针。ClO - 能够通过破坏Caz-Hcy的共轭结构来改变Caz-Hcy的光吸收性质，阻断供受体之间的FRET过程，调控能量转移效率，从而达到监测线粒体中ClO - 的目的。探针的设计原理如 图2 图2 所示。 2.2　Caz-Hcy的光吸收性质 2 首先考察了Caz-Hcy的光吸收性质。如 图3 图3 A所示，Caz-Hcy在400~500 nm范围内具有较强的吸收，最大吸收峰位于466 nm处；而Tm 3+ 掺杂SWUCNPs的蓝光发射峰也恰好位于该处，因此能够和Caz-Hcy的吸收相匹配；Caz-Hcy与ClO - 的氧化产物在此处吸光度较弱，从而阻断能量转移过程。通过Caz-Hcy吸光度与浓度所得标准曲线计算得到Caz-Hcy在其最大吸收波长处的摩尔吸光系数为1.9×10 4 L·mol -1 ·cm -1 （ 图3 图3 B，C）。如此高的摩尔吸光系数能够确保在能量供受体之间有较大的光谱重叠积分的条件下，发生更为有效的能量转移，获得更高的能量转移效率。接着，考察Caz-Hcy对ClO - 响应的情况。随着加入ClO - 浓度的增加，Caz-Hcy中双键被氧化发生断裂，共轭结构被破坏 ［ 29 29 ］ ，因此在466 nm处的吸收逐渐减弱（ 图3 图3 D），当加入ClO - 为17.5 eq（eq为当量）时，该染料的吸收基本微弱到可以忽略。上述实验结果表明，Caz-Hcy的共轭体系确实被ClO - 破坏， 图2 图2 的设计原理得以证实。基于已有的实验结果，我们认为利用Caz-Hcy作为SWUCNPs的能量受体来构建检测细胞线粒体中的ClO - 的上转换纳米探针是可行的。 2.3　SWUCNPs的表征 2 SWUCNPs根据层-层晶种生长法合成，即首先由溶剂热法合成NaYF 4 ：Gd纳米晶作为晶核，随后在其表面外延生长一层NaYF 4 ：Yb，Tm；为减少溶剂对发光离子的猝灭作用，在最外层沉积一层NaYF 4 惰性保护壳，从而获得SWUCNPs。由 图4 图4 A~C可知，所制备的SWUCNPs形貌、尺寸均一，NaYF 4 ：Gd核粒径约为13.6 nm，NaYF 4 ：Gd@NaYF 4 ：Yb，Tm核壳结构纳米颗粒的粒径约为16.4 nm，SWUCNPs粒径约为20.4 nm。因此，发光层壳层厚度为1.4 nm，惰性保护壳厚度为2 nm，发光离子都处于发生FRET的有效距离范围内，从而确保探针具有较高的能量转移效率。通过XRD图也可以看出（ 图4 图4 D），SWUCNPs的衍射峰位置与六方相NaYF 4 （ β -NaYF 4 -16-0034）相一致，说明SWUCNPs为六方晶相。 2.4　Caz-Hcy-SWUCNPs探针的构建及表征 2 Caz-Hcy-SWUCNPs探针通过表面无配体修饰的SWUCNPs（bared-SWUCNPs）表面裸露的稀土离子与Caz-Hcy分子中两个羧基基团的配位作用来构建。如 图5 图5 A所示，当SWUCNPs表面结合的Caz-Hcy量增加时，SWUCNPs在478 nm处发射光强度逐渐降低。如 图5 图5 B所示，当SWUCNPs表面负载的Caz-Hcy浓度达到50 μmol/L时，猝灭效率可达到90%以上（猝灭效率=1- F / F 0 ，其中 F 0 和 F 分别为负载染料前后SWUCNPs的荧光强度）。对该探针进行UV-Vis光谱和Zeta电势的表征，如 图5 图5 C所示，随着加入Caz-Hcy浓度增加，探针在466 nm处的吸收逐渐增强，表明bared-SWUCNPs表面上Caz-Hcy的负载量增加。 由于Caz-Hcy分子中的羧基能够通过配位作用结合bared-SWUCNPs表面正电荷的稀土离子，故SWUCNPs的Zeta电势值由+31.4 mV 位移至+17.2 mV（ 图6 图6 ）。 考察了Caz-Hcy-SWUCNPs探针的热力学稳定性和pH稳定性。将Caz-Hcy-SWUCNPs探针于37 ℃条件下孵育2 h，在不同时间点测试其荧光强度，未发现该探针的荧光强度有明显变化。将探针放置在不同pH值的缓冲溶液中孵育2 h，测试其荧光强度，探针的荧光强度仍未发生明显变化。上述实验结果表明，所构建的Caz-Hcy-SWUCNPs探针具有优异的热力学稳定性和pH稳定性。 2.5　Caz-Hcy-SWUCNPs探针对溶液中ClO - 的检测 2 随后，考察了探针对溶液中ClO - 的响应情况。如 图7 图7 A所示，随着加入探针溶液中ClO - 浓度的增加，该探针478 nm处的发射光逐渐增强，且其荧光增强程度与ClO - 浓度呈正相关。如 图7 图7 B所示，该探针荧光增强倍数与ClO - 浓度在0~100 μmol/L范围内呈线性关系，计算得到ClO - 的检出限（LOD）为0.55 μmol/L。上述实验结果表明，ClO - 的加入确实导致Caz-Hcy 的光吸收性质发生了改变，从而抑制了能量供受体之间的FRET过程，进而使得SWUCNPs荧光恢复。此外，如 图7 图7 C所示，SWUCNPs的荧光恢复程度与反应时间相关，当加入了ClO - 后，反应进行10 min时，SWUCNPs的荧光基本恢复到最大值，继续延长反应时间，探针的荧光基本维持稳定不变，表明探针对ClO - 的响应迅速，有利于进行快速的分析检测。此后，我们考察了该探针对ClO - 响应的特异性，探究了干扰物质对探针荧光的影响。如 图7 图7 D所示，只有在溶液中加入ClO - 后，探针的荧光强度才有明显的恢复，而加入其他物质（金属离子、氨基酸、葡萄糖、蛋白以及其他活性氧类物质）则对探针的荧光强度不会产生明显影响，表明所构建的探针对ClO - 具有良好的选择性。 2.6　Caz-Hcy-SWUCNPs探针对细胞中ClO - 的检测 2 首先探究了探针对细胞存活率的影响。将不同浓度的探针与细胞一起孵育12 h后发现，即使探针浓度高达0.5 mg/mL，细胞存活率仍在80%以上。而细胞成像实验一般选用的探针浓度为0.3 mg/mL，在此条件下，细胞的存活率在85%以上。由此可知，Caz-Hcy-SWUCNPs探针对细胞存活率影响较小，具有优异的生物相容性，可进一步应用于细胞成像。 基于探针的设计原理，所构建的探针能够选择性地富集在线粒体，实现线粒体靶向成像。选取HeLa细胞进行荧光共定位成像，使用商品化线粒体染料MitoTracker Red CMXRos对线粒体进行染色标记，以考察探针靶向结合线粒体的能力。将细胞与探针孵育10 h后，加入PMA刺激细胞产生活性氧，接着加入MitoTracker Red CMXRos对细胞线粒体进行染色。在处理成像数据时，选择了不同区域的细胞，如 图8 图8 A，B所示，均发现探针的荧光与MitoTracker Red CMXRos的荧光之间有重叠。而当细胞与bared-SWUCNPs共同孵育时，如 图8 图8 C所示，SWUCNPs的荧光与MitoTracker Red CMXRos的荧光无法较好地重叠。两者对比，表明染料Caz-Hcy确实能够赋予探针靶向结合线粒体的能力，从而实现线粒体内ClO - 的分析检测。 将探针应用于检测细胞线粒体ClO - 水平的变化，如 图9 图9 A~C所示。在不对细胞进行预处理的情况下，直接加探针孵育，只能看到微弱的荧光，说明在正常状态下，细胞线粒体内的ClO - 含量很低（ 图9 图9 A）。当加入1 μg/mL PMA对细胞进行预处理后，与探针共孵育，能观察到比较明显的荧光，说明PMA能刺激细胞内产生活性氧，进而使探针的荧光得以恢复（ 图9 图9 B）。为了证明该组细胞中探针荧光恢复是探针响应ClO - 的结果，在另一组对照实验中，加入PMA刺激细胞前先加入活性氧清除剂NAC（10 mmol/L）。加入NAC后，探针荧光强度的恢复受到限制（ 图9 图9 C）。综合上述实验结果，所构建的Caz-Hcy-SWUCNPs探针确实能够对线粒体ClO - 含量水平进行检测。 细胞成像图收集波长范围为450~500 nm；标尺:20 μm Images were collected at 450-500 nm； Scale bar: 20 μm 3　 结 语 1 本工作以SWUCNPs为能量供体，Caz-Hcy染料为能量受体构建了检测细胞线粒体内ClO - 的上转换纳米探针。该探针对ClO - 响应速度快，且灵敏度高（LOD=0.55 μmol/L）、选择性好。在所构建的探针中，能量受体Caz-Hcy具有双重作用，不仅能够识别ClO - ，同时由于其含有带正电荷的氮杂环，可赋予探针靶向线粒体的能力。由于Caz-Hcy-SWUCNPs探针对ClO - 具有较好的响应性能及较低的生物毒性，可实现对线粒体中ClO - 的成像分析，为探究线粒体内ClO - 在疾病和生命过程中的作用机制提供新的方法和工具。 参考文献 AOKI T ， MUNEMORI M . 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