用于活细胞成像的黏度荧光探针研究进展

用于活细胞成像的黏度荧光探针研究进展 Progress on Viscosity Fluorescent Probes for Living Cell Imaging first-author 朱清雅，女，硕士生，现从事分子影像研究。E-mail： qingya_zhu@whu.edu.cn 朱清雅，女，硕士生，现从事分子影像研究。E-mail： qingya_zhu@whu.edu.cn qingya_zhu@whu.edu.cn corresp E-mail： kyan@whu.edu.cn E-mail： kyan@whu.edu.cn kyan@whu.edu.cn 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072 College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China 细胞黏度作为一种重要的生理环境参数，影响着物质的转运、代谢、信号传递以及细胞分化与凋亡等生理活动。细胞黏度的变化与多种疾病和功能障碍密切相关。开发可用于细胞成像的黏度荧光探针对理解细胞内的各种生理活动和疾病诊断具有重要意义。本文系统总结了近年来靶向定位不同细胞器且可用于细胞成像的黏度荧光探针，从结构设计、检测机制、生物应用等方面进行概述，同时对其发展趋势和应用前景进行展望。 As an important physiological environmental parameter, cellular viscosity affects nutrient transport, metabolism, signal transduction, cellular differentiation, apoptosis, and other physiological behaviors. At the intracellular level, changes in viscosity are associated with a variety of diseases and dysfunctions. The development of viscosity fluorescent probes for cell imaging is of great significance for the understanding of physiological activities and functions in various cellular processes and the diagnosis of some diseases and dysfunctions. In this review, we systematically summarize the recent progress on organelle-targeted viscosity fluorescent probes for cell imaging, and provide a general overview on structure design, detection mechanisms, and biological applications. The development trend and application prospect of viscosity probes are also discussed. 细胞黏度 荧光探针 细胞器靶向 细胞成像 cellular viscosity fluorescent probe organelle-specific targeting cell imaging 0　 引 言 1 细胞黏度（cellular viscosity）是细胞内一种重要的生理环境参数 ［ 1 1 ］ ，与物质的转运、代谢、信号传递和细胞凋亡等多种生理行为密切相关 ［ 2 2 ， 3 3 ］ 。细胞内不同区域黏度存在较大差异 ［ 4 4 ~ 7 7 4~7 ］ ，黏度水平的异常往往伴随着多种疾病和功能障碍，如糖尿病 ［ 8 8 ］ 、动脉粥样硬化 ［ 9 9 ］ 、阿尔茨海默氏症 ［ 10 10 ］ 和恶性肿瘤 ［ 11 11 ］ 等。因此，监测细胞内的黏度水平对了解生理过程、检测相关疾病具有重要意义。 黏度的测定有多种方法，如转桶法、落球法、阻尼振动法、杯式黏度计法、毛细管法等 ［ 12 12 ］ ，但均不适用于细胞、组织等生物样品的检测。近20年来，随着共聚焦显微成像技术的飞速发展，利用荧光探针分子在不同黏度环境中的光谱变化，已实现对细胞黏度的实时检测和细胞成像，靶向不同细胞器的黏度荧光探针也成为当前研究的热点之一 ［ 13 13 ］ 。已报道的黏度荧光探针主要通过靶向定位线粒体、溶酶体、脂滴、细胞质、细胞膜等细胞器实现对黏度的监测，部分可以跟踪多种细胞生理过程中的黏度变化。本文将总结近年来靶向不同细胞器且应用于细胞成像的黏度荧光探针，从探针的结构设计、检测机制以及在生物成像领域的应用方面进行概述，并对其发展趋势和应用前景进行展望。 1　 黏度荧光探针的检测机制 1 根据不同的检测机制，黏度荧光探针主要分为基于体系的荧光强度、比率荧光、探针自身荧光寿命改变的模式以及基于多种机制同时变化的多重模式。 1.1　基于荧光强度的改变 2 基于荧光强度来监测细胞黏度是最为简单和直观的一种方法 ［ 14 14 ， 15 15 ］ 。大多数黏度荧光探针通过分子转子（rotor）状态的变化感知黏度。低黏度环境下，探针中的分子转子自由旋转，产生扭曲分子内电荷转移（twisted internal charge transfer，TICT），不发射荧光或强度微弱；当黏度增加时，旋转受阻，TICT受到抑制，荧光强度增大，量子产率也相应增加 ［ 16 16 ， 17 17 ］ 。 1.2　基于比率荧光的改变 2 由于探针分子容易在细胞内特定区域发生聚集或自组装现象，使其分布不均，造成探针在细胞局部位置荧光较强，故仅仅通过荧光强度变化来判断所处环境黏度的变化往往是不准确的，比率型荧光黏度探针应运而生。与被测物作用之后，探针的发射波长发生移动，通过两个波长下荧光强度的比值，可以避免细胞内探针分布不均所带来的干扰，还可以检测低黏度细胞区域如细胞质的黏度变化 ［ 18 18 ， 19 19 ］ 。 1.3　基于荧光寿命的改变 2 基于探针自身的荧光寿命的改变检测细胞黏度可摆脱激发光强度、探针浓度、光漂白等因素的影响，且能同时区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，提高检测的准确性和灵敏度。借助荧光寿命成像显微镜（fluorescence life-time imaging microscopy，FLIM），荧光寿命成像技术可以实时反映探针与周围微环境的相互作用及能量转移，具有极高的空间分辨率 ［ 20 20 ］ 。 1.4　基于多重模式的同时变化 2 由于细胞结构和功能的复杂性，采用多重模式测定黏度对细胞黏度成像的实现非常重要，可以大大提高其可视化程度，目前采取的最有效的多重成像模式是荧光寿命和比率荧光成像相结合的方式。 2　 黏度荧光探针的分类 1 2.1　线粒体靶向黏度荧光探针 2 线粒体（mitochondrion）是一种双膜包被结构的细胞器，是细胞进行有氧呼吸的场所，为细胞活动提供能量，还参与信息传递、细胞分化和凋亡等过程 ［ 21 21 ］ 。线粒体的黏度与其生理状态密切相关，线粒体基质中含有大量酶和其他蛋白质，其功能异常会导致基质组分的变化，从而引起线粒体黏度发生变化。研究发现 ［ 22 22 ］ ，线粒体黏度的异常与糖尿病、神经退行性疾病和癌症相关。因此，监测线粒体中黏度的变化对于理解线粒体各种生理活动和功能，辅助相关疾病的诊断和治疗是非常重要的。线粒体基质带有大量负电荷，可通过链接带正电荷的基团实现对线粒体的靶向定位。 Kim课题组 ［ 22 22 ］ 将荧光基团香豆素、氟硼二吡咯（BODIPY）与线粒体靶向分子三苯基膦结合，设计合成了探针 1 （ 图1 图1 ）。随着黏度的增加，两种荧光基团香豆素（427 nm）和BODIPY（516 nm）的荧光强度都有所增加，其中BODIPY基团增加更为显著，荧光强度比值（ I 516 / I 427 ）和荧光寿命（τ 516 ）均与黏度呈现出良好的线性关系。两种成像模式可以检测到宫颈癌细胞HeLa中线粒体黏度的平均值为62 mPa·s，在药物莫能菌素和制霉菌素的作用下，细胞发生凋亡，线粒体黏度增加到110 mPa·s。田玉鹏课题组 ［ 23 23 ］ 报道的探针 2 （ 图1 图1 ）是一种水溶性双光子比率型荧光探针，能有效地利用线粒体膜电位对线粒体进行染色。该探针具有近红外激发、高选择性和信噪比等优点，荧光强度比值（ I 569 / I 384 ）与黏度对数（lg η ）呈现良好的线性关系，细胞成像可区分正常和制霉菌素处理的肝癌细胞HepG 2线粒体黏度的变化。Chang课题组 ［ 24 24 ］ 报道的探针 3 （ 图1 图1 ），由于苯环和BODIPY之间的快速分子内旋转，探针 3 显示微弱的荧光。随着溶剂黏度的增加，荧光强度和量子产率显著增强，且探针的荧光寿命与溶剂黏度呈现良好的线性关系。该探针细胞成像观测到，用可导致线粒体肿胀与功能障碍的莫能菌素作用HeLa细胞后，线粒体黏度显著增加。 肖义课题组 ［ 25 25 ］ 设计合成了一种可与线粒体固定结合（immobilization）的探针 4 （ 图2 图2 ）。该探针中的醛基能与线粒体蛋白质中的氨基反应形成稳定共价键，使之可以固定在线粒体蛋白质上，克服了大多数非固定型探针靠静电作用定位不稳定的问题。当黏度从0.6 mPa·s增加到360 mPa·s，探针 4 在520 nm处的荧光寿命从0.6 ns逐渐增加到5.9 ns。通过细胞FLIM成像，可以监测在药物鱼藤酮和羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）引发的病理状态下线粒体的黏度变化。 Kelley课题组 ［ 26 26 ］ 设计合成了可以同时检测线粒体黏度和极性变化的多功能探针 5 （ 图3 图3 ）。该探针选择了一种靶向线粒体且对细胞膜无损害的多肽为载体，通过检测苯基喹噁啉部分的荧光寿命来测量黏度，通过检测香豆素的发射光谱来测量极性。细胞成像实验发现该探针不仅可以监测肿胀和凋亡诱导试剂对线粒体理化性质的影响，还首次实现了制霉菌素作用下线粒体极性和黏度的定量分析。 阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，现已证实 β -淀粉样蛋白（amyloid β -protein，A β ）是导致该疾病的关键因素 ［ 27 27 ］ ，而线粒体中黏度的改变以及H 2 S、H 2 O 2 的水平异常都与该蛋白的积累有关 ［ 28 28 ］ 。李春艳课题组 ［ 29 29 ］ 合成了一种双功能荧光探针 6 用于监测线粒体黏度和H 2 S水平（ 图4 图4 ）。在低黏度环境中，该探针无荧光信号，随着黏度的增加，探针释放出强烈的红色荧光。另一方面，探针中的叠氮基团与H 2 S反应，可观测到显著的绿色荧光信号。该探针可通过细胞成像监测制霉菌素诱导下的细胞黏度变化，也可检测外源性和内源性H 2 S在线粒体中的浓度，对于研究AD的发病机制具有重要意义。 刘志洪课题组 ［ 30 30 ］ 设计了一个具有较大Stokes位移的近红外荧光探针 7 （ 图5 图5 ）。该探针选择对-频那醇硼苄基作为与H 2 O 2 反应的位点，喹啉季铵盐作为线粒体靶向载体，通过π-共轭桥连噻吩扩大共轭体系使之具有近红外发射性能，并增强血脑屏障的穿透能力。探针在近红外区域对黏度和H 2 O 2 呈现不同的发射光谱，Stokes位移均大于200 nm。该探针能直观跟踪AD小鼠脑内H 2 O 2 和黏度的变化，为AD大脑中H 2 O 2 和黏度提供了更全面的影像。 2.2　溶酶体靶向黏度荧光探针 2 溶酶体（lysosome）是一种由单层膜包被的囊状结构，其腔内pH值范围维持在4.6~5.0之间 ［ 31 31 ， 32 32 ］ 。溶酶体内含有60多种酸性水解酶，能分解老化损伤的细胞器，吞噬消化细胞内的致病菌 ［ 13 13 ］ 。在不同类型细胞中，溶酶体的位置、形态和成分不断变化，是一种动态细胞器 ［ 33 33 ］ 。溶酶体黏度与物质运输、信号传导、代谢产物的扩散和生物大分子间的相互作用密切相关 ［ 34 34 ］ 。溶酶体黏度升高会导致患心脏病、脑梗死、高血压、高脂血症等疾病的危险 ［ 35 35 ］ 。针对溶酶体的定位主要围绕其特殊的酸性展开，吗啉作为最有效的定位基团被广泛应用于各种溶酶体靶向探针中。 肖义课题组 ［ 33 33 ］ 将吗啉与BODIPY荧光分子转子结合，设计合成了监测溶酶体黏度的荧光探针 8 （ 图6 图6 ）。其荧光寿命只对黏度变化产生响应，不受pH和极性的影响，可实时定量检测活细胞溶酶体黏度的变化，成功监测氯喹和地塞米松诱导下乳腺癌MCF-7活细胞溶酶体的黏度变化，是一种理想的具有高时空分辨率的溶酶体示踪剂。余孝其课题组 ［ 36 36 ］ 设计了探针 9 （ 图6 图6 ）。该探针在BODIPY上引入两条水溶性PEG链以降低其细胞毒性，提高水溶性与生物相容性。在吗啉和BODIPY之间引入苯乙炔，扩大共轭体系，增加双光子吸收截面，使之成为双光子激发荧光探针。探针实现了对HeLa细胞内溶酶体黏度的实时检测，并定量研究了地塞米松对溶酶体黏度的影响，发现经地塞米松处理1 h后，HeLa细胞的溶酶体黏度从15 mPa·s增加到159 mPa·s。 蒋健晖与汪凤林课题组 ［ 37 37 ］ 以四苯乙烯为基础开发了具有聚集诱导发光效应的黏度荧光探针 10 和 11 （ 图7 图7 ），用于监测Hela细胞线粒体自噬过程中线粒体与溶酶体的黏度变化，发现由于自噬体的黏度较大，线粒体黏度显著增加，而由于自噬过程中底物降解负担的增加，溶酶体黏度也相应增大。该探针可用于量化线粒体和溶酶体在有丝分裂过程中的黏度变化。 黄楚森课题组 ［ 38 38 ］ 报道了基于对羟基苄烯基咪唑烷酮（HBDI）的有机荧光探针 12 标记溶酶体，并在活细胞中示踪溶酶体黏度（ 图8 图8 ）。HBDI为绿色荧光蛋白（GFP）的发光团，与传统荧光团相比，HBDI荧光团细胞毒性低，易于形成更大的偶联体系以提供不同发射波长。将HBDI与对羟基苯甲醛偶联得到HBDI衍生物（HBDI-derivative），增大π-共轭体系使发射波长更长。该探针可监测溶酶体在地塞米松诱导下的动态黏度变化。 张小玲课题组 ［ 39 39 ］ 将可被过氧亚硝酸根阴离子（ONOO － ，peroxinitrite）氧化的半花菁基团与1，8-萘二甲酰亚胺链接，同时引入了靶向溶酶体的吗啉基团设计合成了探针 13 （ 图9 图9 ）。探针 13 有两个发射峰，510 nm处的荧光发射对ONOO － 产生响应，而610 nm处则对黏度敏感，实现了溶酶体内黏度与ONOO － 的同时检测。当黏度从1.0 mPa·s增加到1 410 mPa·s时，610 nm处的荧光强度增加50倍。通过改变探针 13 与细胞的孵育温度，能够实现对小鼠巨噬细胞RAW 264.7内溶酶体黏度的实时监测。 孟祥明课题组 ［ 40 40 ］ 报道了溶酶体自噬的可视化双光子黏度探针 14 （ 图10 图10 ）。该探针的荧光寿命与黏度呈良好的线性关系，用于检测乳腺癌细胞MCF-7内溶酶体黏度分布，计算出溶酶体黏度分布在9.0~94.8 mPa·s之间，黏度的平均值为45.36 mPa·s。用平衡盐溶液（HBSS）诱导MCF-7细胞发生自噬，收集自噬过程中不同时间的双光子荧光寿命图像，计算得出溶酶体黏度值从46.37 mPa·s增加到63.47 mPa·s，通过检测黏度变化实现对自噬过程的实时监测。张黔玲课题组 ［ 41 41 ］ 报道了一种新型双核铱配合物黏度探针 15 （ 图10 图10 ），通过荧光寿命计算得出肝癌细胞HepG 2、肺癌细胞A549和正常细胞HL-7702溶酶体黏度值分别为55.84、53.10、30.76 mPa·s。这与文献报道的癌细胞的胞内黏度高于正常细胞一致 ［ 42 42 ］ 。该特性可以用于区分肿瘤细胞和正常细胞。张雷课题组 ［ 43 43 ］ 设计合成了溶酶体靶向双功能荧光探针 16 （ 图10 图10 ），用于在细胞中监测黏度和 β -淀粉样蛋白（A β ）。该探针可以探测神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中溶酶体黏度变化，实时跟踪囊泡结构溶酶体的动态运动。无论是体外监测还是共定位A β ，该探针都可以在细胞水平上准确检测A β 蛋白。 2.3　脂滴靶向黏度荧光探针 2 脂滴（lipid droplet）又称脂质体或脂体，是细胞内富含脂质的细胞器，用于调节中性脂质如甘油三酯和胆固醇酯的储存 ［ 44 44 ， 45 45 ］ 。脂滴涉及许多生物学过程，如能量储存和调节、脂肪酸运输和脂质信号分子控制等 ［ 46 46 ］ 。脂滴黏度的异常变化可直接影响其代谢过程 ［ 9 9 ］ ，而脂滴的功能异常也与许多疾病有关 ［ 47 47 ， 48 48 ］ 。 唐本忠课题组 ［ 49 49 ］ 开发了具有聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）特性的双光子荧光探针 17 （ 图11 图11 ）。与低黏度乙二醇相比，该探针在高黏度甘油中发射强度增强了4倍，荧光寿命增加了1.44倍。可通过近红外双光子激发荧光成像，降低光损伤，适于对脂滴的分布和运动进行实时监测。同年，该课题组 ［ 50 50 ］ 又报道了另一种光激活AIE前体黏度探针 18 （ 图11 图11 ）。探针中二氢-2-氮杂芴酮可以通过光激活氧化脱氢（photooxidative dehydrogenation）反应转化为具有AIE性质的2-氮杂芴酮。在405 nm激光照射下，荧光强度随光照时间可迅速增加265倍。该探针不但可以用于脂滴特异性荧光成像，而且能在复杂细胞体系中实现光控高时空分辨荧光成像，通过脂滴的不同表达水平来区分肿瘤细胞和正常细胞。 林伟英课题组 ［ 51 51 ］ 构建了近红外荧光探针 19 （ 图12 图12 ）。该探针含有部花青与烯丙二腈结构，共轭体系的设计使探针呈现近红外激发/发射，在低黏性溶剂中产生微弱的荧光；在高黏性介质中荧光发射显著增强，从低黏度甲醇到高黏度甘油发射强度增加了13.77倍。探针已成功应用于斑马鱼和小鼠活体细胞的黏度变化检测。 林伟英课题组 ［ 52 52 ］ 还设计了另一种双光子荧光探针 20 来检测细胞和斑马鱼中脂滴的黏度变化（ 图13 图13 ）。选用具有刚性稠环结构的咔唑作为荧光团，苯甲醛作为分子转子，增大共轭体系，使发射峰红移。用乙基取代咔唑基9位上的氢原子，增加分子的脂溶性，加强对脂滴的定位。与商业脂滴染料尼罗红共染实验证实该探针对脂滴具有特异性定位，荧光信号的重叠系数高达0.902。在斑马鱼的活体成像中也成功检测到了脂滴的黏度变化。Ahn课题组 ［ 53 53 ］ 开发了一种可同时检测黏度和极性的脂滴探针 21 （ 图13 图13 ）。该探针由给电子基团吡咯烷基与吸电子基团三氰基呋喃基通过乙烯萘连接组成。在极性环境如细胞质中，荧光微弱，而在非极性环境如脂滴中，荧光发射显著增强。同时，在黏度较高的脂滴环境中，探针会比在黏度较低的细胞质中发射的荧光更强。探针 21 已成功应用于小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1中脂滴的成像及黏度检测。 2.4　细胞核和核酸靶向黏度荧光探针 2 细胞核（nucleus）是细胞中储存、复制和传递遗传信息的主要场所，内部含有细胞中大多数的遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA） ［ 54 54 ， 55 55 ］ 。研究发现细胞核的黏度与基因的完整性及其表达有关 ［ 56 56 ］ ，黏度的改变可使RNA的扩散率和移动能力发生5 ~ 50倍的变化 ［ 57 57 ］ ，影响RNA的功能，从而导致心脑血管疾病和动脉粥样硬化等 ［ 58 58 ， 59 59 ］ 血液疾病。检测核酸黏度的异常变化可以为早期疾病的检测提供重要的信息。 郭海明课题组 ［ 57 57 ］ 报道了一种基于核苷的双光子荧光探针 22 ，它可以对网织红细胞RNA区域的黏度进行成像。BODIPY衍生物和2-脱氧腺苷分别作为电子受体（acceptor）和给体（donor），通过乙炔键连接形成共轭体系，以跨键能量转移（through bond energy transfer，TBET）机制产生荧光（ 图14 图14 ）。2-脱氧腺苷可通过氢键相互作用选择性地与RNA尿嘧啶相结合。由于连接BODIPY与苯基的C—C键的旋转程度以及乙炔键的振动幅度而引起TBET的分子构型变化可以使探针 22 在不同波长下产生两种明显的荧光信号，能够检测溶液和细胞黏度的变化，且黏度响应范围为1.8~6.0 mPa·s，适用于活细胞RNA的原位多模式图像黏度测量。 田玉鹏课题组 ［ 60 60 ］ 设计了两种带有 N -甲基苯并噻唑基团的“D-π-A”结构水溶性比率型探针 23 和 24 ，用于核酸黏度的双光子荧光成像（ 图15 图15 ）。这是两种可原位定量细胞黏度的双光子荧光探针第一次被应用于活细胞和组织的DNA与RNA成像。其中， N -甲基苯并噻唑基团作为电子受体，2-（甲胺基）乙醇基团作为电子给体，—OH可与细胞微环境中的其他极性分子形成氢键。探针 23 可以选择性染色细胞核DNA，检测DNA黏度变化，可将细胞核DNA在细胞周期过程中的特征结构变化可视化。而探针 24 在黏性介质中或与RNA结合时荧光显著增强，可以对细胞核和细胞质RNA进行比率荧光成像。 通过Hoogsteen碱基配对，将富含鸟嘌呤（G）的核酸序列折叠，形成了一种非典型核酸结构——G四联体（GQ）DNA。其具有可控的基因表达，能够通过抑制端粒酶的活性来预防肿瘤的发生，被认为是一种新型的癌症诊断和治疗靶点。卢忠林课题组 ［ 61 61 ］ 报道了一种“D-π-A”结构的双光子荧光探针 25 用于细胞核中黏度和GQ DNA的分析（ 图16 图16 ）。探针在甘油中的荧光强度为水中荧光强度的250倍。 N -甲基苯并噻唑阳离子使之能够靶向细胞核 ［ 62 62 ］ ，与商品化细胞核染料DAPI共染实验证实该探针可以特异性定位细胞核，并监测黏度变化，实现“turn-on”型双光子荧光成像。荧光滴定和凝胶电泳实验发现，探针可与GQ DNA产生特异性的相互作用，荧光强度增加27倍。 2.5　内质网靶向黏度荧光探针 2 内质网（endoplasmic reticulum）是连通核膜和细胞膜的封闭的网状管道系统，是蛋白质、脂类和糖类的合成和转运场所。在某些外界因素刺激下，当错误蛋白质或未折叠蛋白质过度堆积、固醇和脂质等水平失调时，内质网发生应激反应，造成内质网黏度和极性的改变 ［ 63 63 ］ ，导致内质网功能紊乱，最终引发细胞凋亡。研究发现 ［ 64 64 ， 65 65 ］ ，内质网应激反应与癌症、代谢疾病、神经退行性疾病等都有密切关系。 Kim课题组 ［ 66 66 ］ 报道了一种双荧光团探针 26 （ 图17 图17 ）。该探针由两个荧光基团尼罗红与BODIPY组成，以线性烷基链相连。用衣霉素诱导HeLa细胞内质网应激后，通过尼罗红 I （575±15） / I （635±15） 的比率成像和BODIPY的荧光寿命FLIM成像，检测到内质网的极性从18.5增加到21.1，黏度从129.5 mPa·s增加到182.0 mPa·s。该课题组 ［ 67 67 ］ 又报道了另一种可以靶向内质网膜的比率型黏度探针 27 （ 图17 图17 ），包含BODIPY和香豆素两个荧光基团，并链接长烷基链实现与内质网膜的靶向定位。两个荧光基团的发射比率由黏度决定，不受极性干扰。该探针与 β -环糊精联用进行细胞成像，可以观测到由各种应激诱导物（棕榈酸、衣霉素或布雷菲德菌素A）造成的内质网膜流动性的降低。屈军乐课题组与Kim合作 ［ 68 68 ］ 报道了能诱导细胞内质网自噬，同时检测内质网黏度的双功能探针 28 （ 图17 图17 ）。通过细胞荧光成像和荧光寿命FLIM成像检测发现，内质网应激和自噬使荧光寿命从2.37 ns增加到2.61 ns，内质网中VDPs周围的黏度从67 mPa·s增加到92 mPa·s，而由自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体（消化未折叠或错误折叠的VDPs）囊泡区域荧光寿命为3.3 ns，黏度达到188 mPa·s。 2.6　细胞质与细胞膜靶向黏度荧光探针 2 真核细胞的细胞质（cytoplasm）由基质（cytosol）、细胞器和包含物组成，是生命活动的主要场所 ［ 69 69 ］ 。细胞膜（membrane）是由脂质、蛋白质和糖类等物质组成的磷脂双分子层结构，防止细胞外物质自由进入细胞，维持稳定的胞内环境 ［ 70 70 ］ 。细胞质基质的黏度与纯水大致相同，但由于基质中大量蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的碰撞，小分子在基质中的扩散速度比在纯水中的扩散速度慢4倍。细胞质、细胞膜黏度增加是细胞凋亡的重要形态学特征 ［ 71 71 ］ ，细胞质黏度的改变会影响到心肌细胞和肺巨噬细胞的生物活性，而细胞膜黏度的增加会使细胞加速老化并增加其癌变的几率。 马会民课题组 ［ 72 72 ］ 报道了一种可以同时监测铁死亡（ferroptosis） ［ 73 73 ］ 过程中·OH的产生和细胞质黏度变化的双功能荧光探针 29 （ 图18 图18 ）。细胞荧光成像证明该探针可以靶向定位细胞质，在铁死亡诱导剂erastin作用下，细胞质黏度的增加，探针分子内的旋转受到限制，从而抑制了TICT过程，绿色通道荧光增强。而铁死亡过程中产生的大量·OH使探针中的苯甲醚羟基化，形成苯酚中间体，进一步发生去质子化和电子重排，最终形成具有近红外发射的π-共轭体系，红色通道出现荧光。 尽管一些特殊结构的、可穿透细胞膜的分子转子已成功用于双分子层 ［ 74 74 ， 75 75 ］ 和单分子层 ［ 76 76 ］ 酯质的黏度探测，但由于活细胞内的内吞作用使细胞膜成像十分困难 ［ 10 10 ］ 。Kuimova课题组 ［ 77 77 ~ 79 79 77~79 ］ 设计了探针 31 和 32 （ 图19 图19 ）。两个探针都可以对黏度产生响应，黏度增大，荧光量子产率和荧光寿命都相应增加。但探针 31 不能定位细胞膜，而探针 32 由于烃链尾端带有两个正电荷可以有效阻止内吞作用，成功用于卵巢癌细胞SK-OV-3的细胞膜黏度成像，细胞双光子荧光成像和FLIM成像结果显示细胞器的平均黏度约200 mPa·s，细胞膜的平均黏度约270 mPa·s。这为进一步发展探针分子转子来区分质/膜结构域或在外部刺激下检测膜流动性的变化奠定了基础。 方敏课题组 ［ 80 80 ］ 合成了咔唑衍生物探针 33 和 34 （ 图19 图19 ）。该类探针分子内存在两种类型的“D-π-A”共轭结构，其中，探针 33 硝基苯肼中的—NH—基团可与CN - 反应（colorimetric response），导致最大吸收波长发生红移，溶液由黄色变为紫色。而探针 34 随着黏度的增加或温度的降低，表现出“turn on”型荧光响应，且单光子和双光子激发的荧光强度与黏度呈对数线性关系，细胞和肝脏组织的双光子成像实验证明该探针定位在细胞膜，可用于监测活细胞和肝脏组织中黏度的变化。 3　 结 语 1 在生命体系中，黏度与多种过程相关，如信号传递、物质运输、蛋白质间的相互作用等。正常细胞内的黏度在1~400 mPa·s之间，黏度异常变化影响细胞正常的功能并引发一系列疾病。因此，设计合成各种黏度荧光探针，实时监测细胞内各个细胞器区域的黏度对研究细胞功能、细胞过程和相关疾病有着重要的意义。 近年来，多种类型的探针包括花菁染料、BODIPY、1，8-萘二甲酰亚胺等被设计合成用来检测活细胞不同细胞器区域内的黏度，不仅在黏度的检测方面得到了迅速的发展，也在生物、医学等领域做出了巨大的贡献。然而，黏度荧光探针在活细胞成像中的应用仍面临一些挑战。比如利用荧光比率和荧光寿命成像可以定量检测细胞区域内的黏度值，但是绝大多数探针只适用于高黏度区域如线粒体、溶酶体等的检测，而不适用于黏度只有1~2 mPa·s的细胞质。而细胞核作为最大的亚细胞器，内含很多遗传物质，但能够用于检测细胞核黏度变化的探针却报道较少。未来的黏度荧光探针研究的发展方向应包括：1）增强靶向性和灵敏度，开发可靶向细胞质、细胞核等细胞器且适合低黏度环境检测的黏度荧光探针；2）优化荧光性能，开发多种机制的黏度荧光探针如双光子、纳米、近红外荧光探针等；3）提高生物相容性，在结构设计上选择如多肽、磷酸酯、聚乙二醇等一些生物相容性好的分子，增加细胞膜穿透性，降低细胞毒性；4）开发荧光成像与其他成像方式相结合的多模态成像，提高成像的安全性和检测的准确性。随着成像仪器和荧光探针的不断改进和更新，黏度荧光探针活细胞成像技术有望在不久的将来得到更为广泛的应用。 参考文献 KAO H P ， ABNEY J R ， VERKMAN A S . 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