聚乳酸定向大孔细胞支架的制备与表征

聚乳酸定向大孔细胞支架的制备与表征 Preparation and Characterization of Poly（ D ， L -Lactic Acid） Directional Macroporous Cell Scaffolds 1 first-author 王友法，男，教授，现从事生物医学材料方面的研究。E-mail：wangyoufa@whut.edu.cn 王友法，男，教授，现从事生物医学材料方面的研究。E-mail：wangyoufa@whut.edu.cn wangyoufa@whut.edu.cn 2 武汉理工大学 材料复合新技术国家重点实验室，湖北 武汉 430070 武汉理工大学 材料复合新技术国家重点实验室，湖北 武汉 430070 State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， Hubei， China State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， Hubei， China 武汉理工大学 材料科学与工程学院，湖北 武汉 430070 武汉理工大学 材料科学与工程学院，湖北 武汉 430070 School of Materials Science and Engineering， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， Hubei， China School of Materials Science and Engineering， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， Hubei， China 采用改进的热致相分离和冷冻干燥相结合的技术，制备了一系列不同孔结构的聚乳酸定向大孔细胞支架材料，用扫描电子显微镜进行表征，探讨了聚乳酸初始浓度、温度梯度和冷却制度对细胞支架形貌及孔结构的影响。结果表明，聚乳酸初始浓度和温度梯度决定了细胞支架的孔道分布、孔隙率和孔径大小，冷却制度决定了支架内部结构的取向形态；使用改进方法，在0 ℃低温介质制备的5%聚乳酸定向大孔细胞支架形貌和结构最优，孔隙率高（90.3%）、孔径大（342±28 μm）、孔壁厚度（10 μm）合适，具有较好的力学强度和生物可降解性，且生物相容性良好。 A series of poly ( D , L -lactic acid) (PDLLA) directional macroporous cell scaffolds were prepared via improved thermal induced phase separation (TIPS) and freeze-drying technique and characterized by scanning electron microscope (SEM). The effects of PDLLA initial concentrations, temperature gradients and lyophilization process on scaffolds morphology and pore structure were investigated. The results show that the PDLLA initial concentrations and the gradients of temperature determine the pore channel distribution, porosity and pore diameter of the cell scaffolds, while the lyophilization method determines the orientation morphology. 5% PDLLA directional macroporous scaffolds prepared by the improved method under 0 ℃ have the best morphology, with higher porosity (90.3%), bigger pore size (342±28 μm) and moderate wall thichness (10 μm). And the biological properties results show that the PDLLA scaffolds can be degraded in phosphate buffer solution (PBS) and have good biocompatibility. 聚乳酸 热致相分离 支架材料 定向孔结构 poly ( D , L -lactic acid) (PDLLA) thermal induced phase separation (TIPS) scaffolds oriented pores 0　 引 言 1 细胞支架作为组织工程的基本要素之一，需要具备如下性能 ［ 1 1 ］ ：1）良好的生物相容性；2）适宜的吸收降解速率；3）良好的孔结构和较高的孔隙率；4）特定的三维立体结构；5）一定的力学强度。良好的细胞支架可以代替细胞外基质，促进细胞生长增殖 ［ 2 2 ］ 。聚乳酸是组织工程中最常用的支架材料之一 ［ 3 3 ， 4 4 ］ ，具有优异的生物相容性、良好的力学强度和可加工性，可完全降解且产物无毒性，是被广泛应用的绿色材料 ［ 5 5 ］ 。Grémare等 ［ 6 6 ］ 利用熔融沉积成型工艺制备了不同孔径的聚乳酸支架。尹浩月等 ［ 7 7 ］ 利用冷冻干燥法制备了聚乳酸多孔支架，且支架符合组织工程的要求。郑辉等 ［ 8 8 ］ 讨论了心源干细胞在层状、球体、纳米纤维3种不同微结构的左旋聚乳酸（PLLA）支架上的生长情况，研究结果显示细胞在这3种微结构的支架上均进行增殖、分化。 细胞支架内部孔结构影响种子细胞的行为。大孔（孔径大于100 µm ［ 9 9 ］ ）有利于细胞的长入以及营养物质的传递和代谢产物的排出，而孔径100~600 µm适合神经组织的修复。在保证支架力学强度的情况下，孔壁厚度5~50 µm为理想状态。由于神经组织细胞呈定向排列，故细胞支架内部也应具有定向结构。具有定向孔道的细胞支架能为细胞的黏附和增殖的方向提供模板和生物地形引导 ［ 10 10 ］ ，细胞根据识别到的指引，呈现沿孔道方向排列和延伸，从而生长成为新的组织。因此，定向孔细胞支架的制备成为重要的研究课题。定向孔细胞支架的制备成型工艺有热致相分离技术、静电纺丝技术和3D打印技术等。其中，热致相分离法具有工艺简单、操作方便的特点 ［ 11 11 ］ ，其原理是聚合物均相溶液在低温环境中发生溶质和溶剂的相分离，溶剂产生晶核并生长，待溶液完全成为固态后，经冷冻干燥，溶剂晶体在低压下直接升华，从而形成了细胞支架内部的孔结构。该方法制备的支架孔结构相互连通、形态良好。但热致相分离技术制备的细胞支架孔结构是各向同性的，而神经组织的修复需要的支架材料孔结构应具有方向性。采用改进的热致相分离技术，将装有聚乳酸溶液的模具置于低温介质表面上，通过创造温度梯度，可以使溶剂结晶具有方向性，从而得到具有方向性的细胞支架。 本研究利用改进的热致相分离法和冷冻干燥相结合的技术制备了聚乳酸细胞支架，并探讨不同聚乳酸初始浓度、温度梯度和冷却介质表面温度对聚乳酸细胞支架内部结构的影响。 1　 实验部分 1 1.1　实验材料及仪器 2 材料：聚乳酸（PDLLA，实验室自制，分子量 M n =76 596 g/mol，分子量分布指数PD=1.85）、1，4-二氧六环（1，4-dioxane，国药集团化学试剂有限公司）、二氯甲烷（DCM，国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4，博士德生物工程有限公司）；实验用水为超纯水。 制备用仪器：DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司），LGJ-10冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂），DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），KL-UP-UV-10型超纯水机（成都康宁科技发展公司）。 测试用仪器：Zeiss Ultra Plus场发射扫描电子显微镜（Zeiss公司），RGM-30A型微机控制电子万能材料试验机（西安明克斯公司），HH-2型数显恒温水浴器（金坛市荣华仪器制造公司），pH分析仪（上海雷磁仪器有限公司）。 1.2　聚乳酸细胞支架的制备 2 分别称取不同质量的聚乳酸于烧瓶中，加入200 mL 1，4-二氧六环溶剂，于60~80 ℃搅拌至完全溶解，得到不同初始浓度（3%、4%、5%、6%、7%）的聚乳酸溶液。将各聚乳酸溶液分别倒入聚四氟乙烯模具（内径10 mm、高15 mm的圆柱体）中，置于0 ℃低温介质表面上，套上保温隔热层泡沫，聚四氟乙烯模具顶部温度为25 ℃。保持温度冷却10 h。待溶液凝固后，置于冰箱中-20 ℃冷却3 h，使其充分固化。取出凝固完全的细胞支架，于-50~-60 ℃、真空度-0.1 MPa冷冻干燥3 d，再放入真空干燥箱中，真空度-0.1 MPa，干燥至恒重，脱模即得到不同初始浓度的聚乳酸细胞支架，根据聚乳酸初始浓度（3%、4%、5%、6%、7%）分别编号为P3、P4、P5、P6、P7支架。 聚乳酸初始浓度为5%，改变冷却介质表面温度，其他条件不变，得到不同温度（-20、-80 ℃）梯度制备的细胞支架，分别称为P5（-20）、P5（-80）支架。 聚乳酸初始浓度为5%，改变冷却制度，置于0 ℃低温介质内部，得到不同冷却制度制备的聚乳酸细胞支架，称为T5支架。 1.3　聚乳酸细胞支架的性能表征 2 1.3.1　细胞支架的孔隙率 3 利用比重法测量细胞支架的孔隙率。在20 ℃环境中，向25 mL毛细管塞密度瓶中加满无水乙醇至刻度线，称其质量记为 m 1 ，支架样品初始质量记为 m s 。将支架样品浸入无水乙醇中，轻微抽真空1 h以除去密度瓶中的气泡，使支架内部空隙充满无水乙醇，再向瓶中添加无水乙醇至满，称其质量记为 m 2 。从密度瓶中缓慢取出支架样品，称密度瓶及瓶内剩余的无水乙醇质量记为 m 3 。按（1）~（3）式计算支架样品的孔隙率 ε ： ε=V p /(V p ＋V s )=(m 2 －m 3 －m s )/(m 1 －m 3 ) V p =(m 2 －m 3 －m s )/ρ V s =(m 1 －m 2 ＋m s )/ρ 式中， V p （mL）为样品的孔隙体积， V s （mL）为样品（不包括孔隙）的体积， ρ 为无水乙醇的密度（0.8 g/mL）。 1.3.2　细胞支架的形貌 3 将聚乳酸细胞支架样品浸入液氮中保持约3 min，迅速取出，在其横截面和纵截面上切片。在样品切片表面喷金，使用场发射扫描电子显微镜对样品的横纵截面进行形貌表征，得到聚乳酸细胞支架样品的微观结构形貌图。 1.3.3　细胞支架的平均孔径 3 利用ImageJ软件测量不同聚乳酸细胞支架样品横截面扫描电镜图中的平均孔径。平均孔径的测量计算方法为：先逐个测量每个孔的最长直径和最短直径，取其平均值，得到每个孔的直径，再将所有孔的直径取平均值，即为该支架样品的平均孔径。 1.3.4　细胞支架的力学强度 3 利用微机控制电子万能材料试验机分别对P5和T5细胞支架样品进行纵向和横向的压缩强度测试，每组5个平行样，压缩速率为1 mm/min。 1.3.5　细胞支架的体外降解性能 3 1） pH值测定。将P5细胞支架样品切成高5 mm、直径10 mm的圆柱状样品，放入降解管中，加入3 mL 磷酸缓冲溶液（PBS）中，置于恒温摇床37 ℃，120 r/min降解12周（ n =5）。在降解的0、1、2、4、6、8、12周，测定降解液的pH值。 2） 失重率测定。在开始降解之前，分别称量每个样品的初始质量记为 m 0 ，之后分别在降解1、2、4、6、8、12周时，取出样品，用超纯水冲洗5次，并用滤纸擦拭样品表面残余液体，在35 ℃环境中真空干燥至恒重，称其质量记为 m 。计算得到样品的失重率（weight loss rate）： 失重率=(m 0 －m)/m 0 ×100% 3） 降解后样品的形貌表征。12周后取出样品，用水冲洗并干燥，浸入液氮中3 min后迅速取出，在纵截面方向切片，表面喷金后用扫描电子显微镜进行形貌表征。 1.3.6　细胞支架的细胞毒性 3 将P5细胞支架在纵截面方向切片，得到与96孔板孔洞相同大小的片状样品。用75%酒精浸泡样品30 min，PBS冲洗3次，1640培养基置换，在超净工作台内风干，利用紫外线照射灭菌。培养L929细胞至长成致密单层，将培养瓶中的原液取出，用5 mL PBS清洗后，加入0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶1 mL，放入二氧化碳培养箱中消化2 min，至70%细胞脱离培养瓶，加入4 mL培养基终止消化，1 000 r/min离心去除上清液，加入10 mL培养基使细胞悬浮，计数，以每孔2×10 3 个细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞分为阴性对照组和PDLLA支架实验组，每组5个平行样，培养24 h后，除去培养液，分别放入已灭菌的样品，并添加一定量的培养液，分别培养24、48、72 h，在96孔板中每孔添加20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，5 mg/mL），继续培养4 h。吸除培养液，每孔中添加150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡培养10 min，用酶标仪于490 nm处测量各孔的光密度值OD。并按（5）式计算细胞的相对增殖率RGR（%）来判别细胞毒性级别： RGR=OD 实验组 /OD 对照组 ×100% （5） 2　 结果与讨论 1 2.1　细胞支架的形貌 2 2.1.1　聚乳酸初始浓度的影响 3 P3~P7细胞支架样品横纵截面的SEM图如 图1 图1 所示，根据 图1 图1 测得样品的孔隙率和平均孔径如 表1 表1 所示。 A：P3；B：P4；C：P5；D：P6；E：P7 支架 低温介质温度/℃ 聚乳酸初始浓度/% 平均孔径/μm 孔隙率/% P3 0 3 — 94.9 P4 0 4 348±32 92.1 P5 0 5 342±28 90.3 P6 0 6 310±26 86.0 P7 0 7 201±20 80.2 P5（-20） -20 5 174±20 86.8 P5（-80） -80 5 132±18 81.9 由 图1 图1 可知，P3~P7细胞支架样品内部均形成了定向大孔结构。其中，P3细胞支架内部孔结构不规整，出现了远大于350 μm的孔，无法测量其平均孔径，且孔壁较薄、出现坍塌，可能导致力学强度不足（ 图1 图1 A）。P4~P7细胞支架样品随着聚乳酸初始浓度由4%增加至7%，平均孔径从348±32 μm下降至201±20 μm（ 图1 图1 B~E， 表1 表1 ），孔结构规则，孔尺寸较均匀，孔壁厚度略有增加，均在10~30 μm范围内。高孔隙率和大孔径可以增大支架材料与细胞的接触面积，有利于细胞在支架上的黏附、增殖和分化，以及氧气的运输、营养物质的供给和细胞代谢废物的及时排出 ［ 12 12 ］ ，但孔径过大可能会导致部分结构坍塌，适中的孔径既可以为细胞的生长和新陈代谢提供足够的空间，又可以保证支架的内部结构保持早期完整 ［ 13 13 ］ ；而较薄的孔壁厚度有利于支架的降解 ［ 14 14 ］ 。因此，P5细胞支架可能具有最优的力学及降解性能。 由 表1 表1 结果还可以看到，相同温度梯度和冷却介质表面温度下，聚乳酸初始浓度对细胞支架的孔隙率影响也较显著。当聚乳酸初始浓度从3%增大至7%（P3至P7）时，对应的孔隙率从94.9%下降至80.2%。这是由于聚乳酸初始浓度较高时，其溶剂（1，4-二氧六环）含量较低，冷冻干燥后结晶少、产生的孔道也较少，导致细胞支架孔隙率较低。 2.1.2　温度梯度的影响 3 聚乳酸初始浓度为5%条件下，对比分析不同温度梯度得到的细胞支架样品P5、P5（-20）、P5（-80）的横纵截面SEM图（ 图1 图1 C、 图2 图2 ），对应的平均孔径及孔隙率数据见 表1 表1 。可以看出，不同温度梯度制备的聚乳酸细胞支架样品均具有定向孔结构，但孔结构形态不同。与P5细胞支架（ 图1 图1 C）相比，P5（-20）细胞支架孔结构不规则，孔径较小（平均孔径174±20 μm），纵截面出现小圆孔（ 图2 图2 A）；P5（-80）细胞支架孔结构规整度进一步降低，孔径更小（平均孔径132±18 μm），纵向小圆孔增多（ 图2 图2 B）。当冷却温度梯度较大时，溶剂会产生许多小晶核，在冷冻干燥过程中溶剂升华就形成了圆孔。小圆孔的出现阻断了孔道的延长，可能导致孔结构中断，影响孔支架的尺寸，不利于长段神经缺损的修复。相对而言，P5细胞支架的定向孔道具有孔道长、取向稳定的特点。长的定向孔道更利于细胞迁移和定向生长 ［ 15 15 ， 16 16 ］ ，因而P5更适合于长段神经缺损的修复。 A：P5（-20）；B：P5（-80） 比较不同温度梯度制备的聚乳酸细胞支架孔隙率（ 表1 表1 ），低温介质温度从0 ℃下降至-20 ℃和-80 ℃，温度梯度增大，孔隙率从90.3%分别下降至86.8%和81.9%，平均孔径从342±28 μm分别下降至174±20 μm和132±18 μm，细胞支架的孔隙率和平均孔径均随温度梯度的增大而降低。 2.1.3　冷却制度的影响 3 对比分析聚乳酸初始浓度为5%、相同冷却介质表面温度、不同冷却制度（有无温度梯度）得到的细胞支架样品P5和T5横纵截面的SEM图（ 图1 图1 C、 图3 图3 ），可以看出，聚乳酸支架样品的孔结构有较大差异。利用改进的热致相分离法制备出P5细胞支架横、纵截面孔结构形貌不同，表明孔结构具有方向性，且孔道规整，排列有序（ 图1 图1 C）。而利用传统的热致相分离法制备的T5细胞支架横、纵截面孔结构相似，孔洞连接良好，分布较均匀，但孔道取向不明显（ 图3 图3 ）。故P5细胞支架相对于T5细胞支架，更有利于周围神经的定向再生。 根据 表1 表1 ，所测定的细胞支架样品孔隙率均高于80%，除P3外，其他支架孔径均在132±18~348±28 μm范围，满足神经组织工程对支架材料孔结构的要求。 2.2　细胞支架的力学性能 2 根据P5和T5细胞支架样品的力学性能结果，P5样品的纵向屈服强度为0.41 MPa，横向屈服强度为0.17 MPa，前者明显大于后者，表明具有定向大孔的细胞支架在力学性能方面也表现为各向异性，沿着孔道延伸方向的力学支撑性能更好，利于长段神经的再生。而T5细胞支架样品的纵向屈服强度为0.32 MPa，横向的屈服强度为0.31 MPa，两者相近，在力学性能方面表现为各向同性，各个方向的支撑性能相近，对于具有一定长径比的神经修复支架材料而言是不合适的。P5和T5细胞支架样品的力学性能表征结果与孔结构的表征相互印证。P5细胞支架更适合于周围神经的定向再生。 2.3　细胞支架的体外降解性能 2 2.3.1　降解液的pH值变化 3 图4 图4 以P5细胞支架为例给出降解液pH值随时间的变化。可以看出，P5细胞支架降解液的pH值随降解时间的延长而降低，且在前6周pH值下降速度较快，从7.40下降至6.61，而6周后下降速度明显趋缓，经过12周，降解液的pH值降至6.52。降解液pH值不断下降是因为聚乳酸支架在PBS缓冲溶液中降解产生了呈酸性的乳酸 ［ 17 17 ］ 。局部的酸性环境是不利于组织再生的，因而可考虑采取措施中和聚乳酸降解带来的局部微酸性以维持中性的细胞生长环境 ［ 18 18 ］ 。 2.3.2　支架失重率的变化 3 图5 图5 为P5细胞支架失重率随时间的变化。可以看出，P5细胞支架的失重率随时间的增加而增大，在第2~6周，P5细胞支架失重率的变化逐渐变缓，第6周时达到6.5%；第6周后降解速度加快，失重率的变化加快，经过12周的降解，P5细胞支架失重率达12.7%。分析其原因，降解发生的前2周，主要是分子量较低的聚乳酸在振荡过程中从支架上脱落，降解为乳酸单体 ［ 19 19 ］ ；同时部分分子量较高的聚乳酸链发生缓慢的酯键断裂，产生质量损失。降解后期，大分子量的聚乳酸链逐渐断裂，生成乳酸，酸性增强，形成酸致自催化效应 ［ 19 19 ］ ，降解速度加快，质量损失加快。P5细胞支架降解失重率变化规律基本匹配周围神经再生速度，符合周围神经再生对植入支架材料的降解速度要求。 2.3.3　细胞支架材料降解后的形貌分析 3 图6 图6 为降解12周后P5细胞支架的纵截面SEM图。可以看出，经过12周的降解，P5细胞支架的孔壁受到一定的破坏，孔壁产生许多孔洞，但细胞支架的整体孔结构保持较好，未发生崩塌现象，仍具有一定的力学强度，说明支架材料具有较好的力学强度。 2.4　细胞支架的细胞毒性 2 细胞在支架上培养一段时间后，根据其光密度值可以计算相对增殖率，从而判定支架的毒性级别。从 表2 表2 可以得出，在培养24、48、72 h后，P5细胞支架组细胞的OD值较高，RGR值较大，即该聚乳酸细胞支架材料的毒性级别为Ⅰ级，证明该支架材料的生物相容性较好。 时间/h OD 实验组 OD 对照组 RGR/% 毒性级别 24 0.149 3 0.166 3 89.78 Ⅰ 48 0.236 5 0.302 5 78.18 Ⅰ 72 0.568 6 0.655 9 86.69 Ⅰ 3　 结 语 1 本文利用改进的热致相分离法，与冷冻干燥技术相结合制备了一系列聚乳酸细胞支架，并探究了聚乳酸初始浓度、温度梯度和冷却制度对支架形貌、孔结构的影响。研究结果表明，P5细胞支架形貌和结构最优，孔隙率高于90%，平均孔径适中（342±28 μm），且孔壁较薄（10 μm）。对P5细胞支架进行了力学强度、体外降解性和生物相容性测试，结果表明该细胞支架具有一定的压缩强度，可以为细胞的生长增殖提供力学支撑；可降解，细胞毒性小，生物相容性好。综上所述，冷却制度决定了聚乳酸细胞支架内部结构的取向形态，而聚乳酸初始浓度和温度梯度决定了聚乳酸细胞支架的孔道分布、孔隙率和孔径大小。通过控制不同的制备条件可以调节支架形貌，得到具有理想孔结构的聚乳酸定向大孔细胞支架。 参考文献 吴林波 ， 丁建东 . 组织工程三维多孔支架的制备方法和技术进展 ［J］. 功能高分子学报 ， 2003 ， 16 （ 1 ）： 91 - 96 . 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