水液相下羟基自由基诱导半胱氨酸分子损伤的机理 Mechanism of Cysteine Molecular Damage Induced by Hydroxyl Radical in Water-Liquid Phase Environment 1 first-author 喻小继，男，高级实验师，硕士，现从事计算机应用化学研究。E-mail： yuxiaoji@mail.ccsfu.edu.cn 喻小继，男，高级实验师，硕士，现从事计算机应用化学研究。E-mail： yuxiaoji@mail.ccsfu.edu.cn yuxiaoji@mail.ccsfu.edu.cn 2 3 3 2 2 corresp E-mail： 115721119@qq. com E-mail： 115721119@qq. com 115721119@qq. com 2 corresp tonghua699@126.com tonghua699@126.com tonghua699@126.com 长春师范大学 外国语学院，吉林 长春130032 长春师范大学 外国语学院，吉林 长春130032 School of Foreign Languages，Changchun Normal University，Changchun 130002，Jilin，China School of Foreign Languages，Changchun Normal University，Changchun 130002，Jilin，China 白城师范学院 理论计算中心，吉林 白城137000 白城师范学院 理论计算中心，吉林 白城137000 Theoretical Computing Center，Baicheng Normal University，Baicheng 137000，Jilin，China Theoretical Computing Center，Baicheng Normal University，Baicheng 137000，Jilin，China 长春师范大学 网络中心，吉林 长春130032 长春师范大学 网络中心，吉林 长春130032 Network Center，Changchun Normal University，Changchun 130002，Jilin，China Network Center，Changchun Normal University，Changchun 130002，Jilin，China 采用密度泛函理论的M06-2X和MN15方法，结合自洽反应场理论的SMD（solvation model based）模型方法，研究了水液相下羟基自由基（OH • ）诱导半胱氨酸分子（Cys）损伤的反应机理。研究发现：Cys的损伤可通过OH • 抽取其H原子、OH • 加成到羧基C和单电子从Cys分子向OH • 转移3个通道实现。势能面计算表明：OH • 加成到羧基C的反应通道最具优势，是无势垒过程；OH • 抽取 α -H、质子化氨基H、巯基H和亚甲基H的最低能垒分别是12.5、4.6、7.3、8.9 kJ/mol；电子从Cys向OH • 转移的反应为劣势通道，能垒为93.5 kJ/mol。结果表明，水液相下OH • 容易导致Cys分子损伤。 The reaction mechanism of cysteine molecular damage induced by hydroxyl radical in water-liquid phase environment was studied by means of M06-2X and MN15 methods based on density functional theory and SMD（solvation model based） model method of self consistent reaction field theory. The study shows that the damage of Cys can be achieved by three ways: OH • extracting its H atom, OH • adding to carboxyl C and single electron transferring to OH • from Cys molecule, all of which could induce Cys damage. Investigation on the potential energy surface shows that the reaction of OH • adding to carboxyl C has the most advantage, and the process is barrier-free; the lowest barriers for OH • radicals extracting α -H and protonating amino group H, mercapto group H and methylene H are 12.5, 4.6, 7.3 and 8.9 kJ/mol, respectively. The reaction of electron transferring to OH • from Cys molecule is a disadvantage channel with the barrier as 93.5 kJ/mol. The results show that OH • can cause Cys molecular damage easily in water-liquid phase environment. 半胱氨酸 羟基自由基 密度泛函理论 过渡态 电子转移 能垒 损伤 cysteine hydroxyl radical density functional theory transient state electron transfer energy barrier damage 0　 引 言 1 半胱氨酸（cysteine，Cys）是组成蛋白质的重要氨基酸，按旋光性分为左旋、右旋半胱氨酸（ L -Cys和 D -Cys），按构型分为 S 型、 R 型半胱氨酸（ S -Cys和 R -Cys）。生命体内具有活性的是 L -Cys，肽链上的两个 L -Cys残基间通过二硫键(—S—S—)连接，能够保持蛋白质立体结构的稳定性 [ 1 1 ] 。 L -Cys广泛用作保鲜剂、增香剂和抗氧化剂等 [ 2 2 ] 。 D -Cys能够抑制大肠杆菌 [ 3 3 ] 、缓解酒精中毒 [ 4 4 ] 、 作为手性药的重要中间体 [ 5 5 ] 以及合成头孢类抗生素 [ 6 6 ] 。由于 L -Cys和 D -Cys的作用不同，人们对其旋光异构进行了研究。水汽环境下Cys旋光异构的能垒为95.3 kJ/mol [ 7 7 ] ，水液相下旋光异构的能垒为104.0 kJ/mol [ 8 8 ] 。 富水的生命体内有羟基自由基(OH • )存在，因此研究OH • 诱导氨基酸损伤，对指导人们科学、安全、高效地使用氨基酸具有重要意义。OH • 抽取赖氨酸、 α -丙氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的 α -H原子，诱导它们损伤的能垒在23.8~32.6 kJ/mol之间 [ 9 9 ~ 12 12 9~12 ] ；抽取 α -H原子的能垒为41.3 kJ/mol，抽取杂环H的最低能垒为33.3 kJ/mol [ 13 13 ] 。考虑到OH • 可通过抽氢、加成和单电子转移等3类反应诱导氨基酸和DNA等分子损伤 [ 14 14 ， 15 15 ] ，基于已有的研究 [ 12 12 ， 13 13 ， 16 16 ， 17 17 ] ，本文探讨了水液相下OH • 诱导Cys分子的损伤机理。 1　 计算方法 1 采用计算主族元素体系有较好表现的M06-2X泛函 [ 18 18 ~ 20 20 18~20 ] 方法，在基组6-311+G(d, p)下优化双重态势能面上的驻点。通过对过渡态 [ 21 21 ] 虚频振动模式的分析和IRC（内禀反应坐标）计算 [ 22 22 ] ，确认过渡态与对应稳定点的关联性。为计算出精确的反应过程势能面，采用更高精度描述体系色散作用的泛函MN15 [ 23 23 ] 方法，在高角动量劈裂价键基组6-311++G(2df, pd)水平计算单点能。水溶剂效应采用SMD模型 [ 24 24 ] 方法处理。络合物的结合能及解离能计算采用零点振动能校正，络合物异构反应势能面的计算采用自由能热校正。采用NBO自然键轨道理论和分子中的原子理论(AIM)，计算主要物种的NPA（natural population analysis）电荷、成键临界点（BCP）和成环临界点（RCP）的电荷密度( ρ )及电荷密度的拉普拉斯值( <math id="M1"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 )。 文中的加成反应无势垒，其势能面是在M06-2X/ SMD/ 6-311+G(d, p)水平对羧基C和OH • 从0.400 0 nm到0.120 0 nm范围内进行刚性扫描获得。电子转移过程无过渡态，反应的自由能垒采用马库斯（Marcus）理论 [ 25 25 ， 26 26 ] 计算，能垒计算公式为： <math display="block" id="M2"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mo>≠</mo></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526062&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526060&type= 9.39799976 3.97933316 = λ /4(1+ <math display="block" id="M3"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">o</mi></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526129&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526126&type= 9.39799976 3.97933316 / λ ) 2 λ = Δ E SET - <math display="block" id="M4"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">o</mi></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526136&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526148&type= 9.39799976 3.97933316 其中， λ 是重组能，Δ E SET 是产物和反应物的非绝热能量之差， <math id="M5"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">o</mi></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526172&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526158&type= 9.39799976 3.97933316 是产物和反应物的自由能之差。 在反应通道a，反应物 R -Cys与OH • ·H 2 O（羟基自由基水簇）氢键作用形成的复合物记作 R -Cys·OH • ·H 2 O a ，无手性过渡态记作T·OH • ·H 2 O a ，损伤的无手性产物记作P *a ，损伤产物与二聚水的复合物记作P * ·(H 2 O) 2 a ，其他物种的表示方法与此相似。 文中驻点结构及其NPA电荷和单点能计算采用Gaussian16程序 [ 27 27 ] ，电荷密度 ρ 及电荷密度的拉普拉斯值 <math id="M6"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 采用AIM 2000程序 [ 28 28 ] 计算。 2　 结果与讨论 1 水液相下的氨基酸是两性分子构象最稳定 [ 20 20 ， 29 29 ] 。对水液相下两性Cys分子进行全势能面扫描得到的最稳定构型见 图1 图1 。计算表明，OH • 的O原子和H原子的电子自旋密度分别为1.025和-0.025，单电子主要集中在O上，因此，O是OH • 与 R -Cys反应的反应位原子。 OH • 可与 R -Cys进行抽氢、加成和单电子转移等3类反应。对于抽氢反应，理论上OH • 可抽取 R -Cys分子中不同位置的H原子，然而H6所在的位置使得羟基自由基水簇很难和其氢键作用，因此本文不讨论抽H6的过程。抽 α -H、质子化氨基H、巯基H和亚甲基H的通道分别命名为a、b、c和d；对于加成反应，只有去质子羧基的碳原子C8不饱和，OH • 只能加成到C8上，此通道命名为e；单电子从 R -Cys向OH • 转移的通道命名为f。 2.1　抽H过程 2 水液相下OH • 少量存在，多数是与H 2 O、(H 2 O) 2 和(H 2 O) 3 等形成自由基水簇。不同的H原子所处的空间位置不同，自由基（水簇）可能会以不同的形式与氢及氧氢键作用形成反应物复合物，不同的通道可能会是OH • 、OH • ·H 2 O或OH • ·(H 2 O) 2 抽H的一种或几种形式，对OH • 抽H的通道只作简要的讨论。计算表明，对确定的反应通道，OH • 、OH • ·H 2 O、OH • ·(H 2 O) 2 抽H的产物相同。 2.1.1　a通道 3 此通道考查了OH • 、OH • ·H 2 O和OH • ·(H 2 O) 2 抽 α -H的3种情形，反应历程见 图2 图2 ，势能面见 图3 图3 。为节省篇幅，只对第2种情形给予详细讨论，第1和第3情形给予一般讨论。 情形1：OH • 抽 α -H。首先，OH • 与 R -Cys的H12和O10氢键作用，形成复合物 R -Cys·OH •a ，放热18.7 kJ/mol。所放热量被水溶剂迅速吸收，不会作为下步反应的可资用能，后文相似之处不再重复。然后， R -Cys·OH •a 经过渡态 R -T·OH •a ，OH • 抽取H12，得到产物P * ·H 2 O a 。P *a 失去手性，NPA电荷计算表明，其与 R -Cys相比较电荷分布显著变化（见图S1，附加材料），P *a 是 R -Cys严重损伤的产物。从 R -Cys·OH •a 到T·OH •a ，C1—H12从0.109 1 nm拉伸至0.116 8 nm，BCP电荷密度计算表明共价键显著变弱；二面角N5—C1—C3—C8从121.6°增加至128.0°，T·OH •a 产生了27.0 kJ/mol的内禀能垒。最后，P * ·H 2 O a 吸收10.1 kJ/mol的能量解离成P *a 和H 2 O，此过程可通过分子碰撞实现。从 图3 图3 可以看出，P *a 修复的能垒为130.8 kJ/mol，此能垒远高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明P *a 难以修复。NPA电荷计算表明，P * ·H 2 O a 的P * 和H 2 O的电荷均为0，说明从 R -Cys·OH •a 经T·OH •a 到P * ·H 2 O a 过程是H原子迁移，后文相似之处不再说明。 情形2：OH • ·H 2 O抽 α -H。首先，OH • ·H 2 O与H12和O10氢键作用，形成复合物 R -Cys·OH • ·H 2 O a ，放热16.3 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O a 经过渡态T·OH • ·H 2 O a ，OH • ·H 2 O抽取氢原子H12，得到产物P * ·(H 2 O) 2 a 。从 R -Cys·OH • ·H 2 O a 到T·OH • ·H 2 O a ，C1—H12从0.109 2 nm拉伸至0.117 1 nm， ρ 从0.281 8 a.u.减小至0.221 8 a.u.， <math id="M7"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 从-0.974 9变为-0.599 2，共价键略有减弱；C1—H12—O15—H19—O17—H18—O10—C8环的 ρ 从0.0 a.u.增加至0.005 2 a.u.， <math id="M8"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 从0.0变为0.013 5，过渡态成环；二面角N5—C1—C3—C8从121.9°微增加至127.8°，T·OH • ·H 2 O a 产生了12.5 kJ/mol的内禀能垒。此过程OH • ·H 2 O的H 2 O未参与反应，只是起到稳定OH • 空间位置的作用。最后，P * ·(H 2 O) 2 a 吸收13.8 kJ/mol的能量解离成P *a 和(H 2 O) 2 。从 图3 图3 可看出，P *a 修复的能垒为125.9 kJ/mol，说明Cys在此过程的损伤难以修复。T·OH • ·H 2 O a 比T·OH •a 产生的能垒低一倍多，原因有二：一是T·OH • ·H 2 O a 成环，而T·OH •a 不成环；二是 R -Cys·OH • ·H 2 O a 比 R -Cys·OH •a 的C1—H12长，键电荷密度较小，红外振动频率较小，前者的C1—H12键活化程度高。 情形3：OH • ·(H 2 O) 2 抽 α -H。首先OH • ·(H 2 O) 2 与H12和O10氢键作用，形成 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 a ，放热21.1 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 a 经过渡态T·OH • ·(H 2 O) 2 a ，(H 2 O) 2 辅助OH • 抽取H12，得到产物P * ·(H 2 O) 3 a 。从 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 a 到T·OH • ·(H 2 O) 2 a ，C1—H12从0.109 2 nm拉伸至0.117 8 nm，共价键减弱；环电荷计算表明，C1—H12—O15—H16—O21—H22—O10—C8成环，T·OH • ·(H 2 O) 2 a 产生了16.8 kJ/mol的内禀能垒。最后，P * ·(H 2 O) 3 a 吸收21.5 kJ/mol的能量解离成P *a 和(H 2 O) 3 。从 图3 图3 可以看出Cys在此过程的损伤也难以修复。此过程反应物复合物的结合能以及产物复合物的解离能比前两种情形的大很多，原因是此过程反应物复合物及产物复合物存在π-π相互作用。 2.1.2　b通道 3 此通道羟基自由基（水簇）无法抽氨基氢H6（H6的位置使羟基自由基水簇无法与其氢键作用），故只讨论抽H7和H11的情形，分别命名为b1和b2通道，此通道只考察OH • ·H 2 O抽H，反应历程见 图2 图2 ，势能面见 图3 图3 。为节省篇幅，对b1通道详细讨论，b2通道给予一般讨论。 1） b1通道。首先，OH • ·H 2 O与 R -Cys的H7和O9氢键作用，形成复合物 R -Cys·OH • ·H 2 O b1 ，放热50.9 kJ/mol，说明 R -Cys·OH • ·H 2 O b1 存在分子间氢键。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O b1 经过渡态 R -T·OH • ·H 2 O b1 ，H 2 O辅助OH • 抽取H7原子，异构成产物复合物 R -P * ·(H 2 O) 2 b1 。NPA电荷计算表明， R -P *b1 与 R -Cys相比较电荷分布发生了变化，因此 R -P *b1 是 R -Cys的损伤产物。从 R -Cys·OH • ·H 2 O b1 到 R -T·OH • ·H 2 O b1 ，N5—H7从0.106 2 nm拉伸至0.128 2 nm，BCP电荷密度 ρ 从0.292 0 a.u.减小至0.157 1 a.u.， <math id="M9"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 从-1.578 7变为-0.242 0，共价键减弱；RCP电荷密度计算表明，过渡态的N5—H7—O15—H16—O17—H18—O9成环；C8—C1右视逆时针旋转4.5°， R -T·OH • ·H 2 O b1 产生的内禀能垒仅4.6 kJ/mol。该能垒明显小于T·OH •a 、T·OH • ·H 2 O a 和T·OH • ·(H 2 O) 2 a 产生的能垒，主要原因有二：一是 R -Cys·OH • ·H 2 O b1 的N5—H10的红外振动频率仅2 696.2 cm -1 ，N5—H10键被很好地活化；二是T·OH • ·H 2 O b1 的环电荷密度高，过渡态成环。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 b1 放热47.1 kJ/mol，解离成 R -P * b1 和(H 2 O) 2 。从 图3 图3 可以看出，在b1通道修复 R -P * b1 的能垒为47.6 kJ/mol，此能垒远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明Cys在b1通道的损伤可以修复。 R -P * ·(H 2 O) 2 b1 解离成 R -P *b1 和(H 2 O) 2 是放热过程，原因是 R -P * ·(H 2 O) 2 b1 中的 R -P * 构象不稳定，其能量远高于 R -P *b1 的能量。 2） b2通道。首先，OH • ·H 2 O与 R -Cys的H11和O9氢键作用，形成 R -Cys·OH • ·H 2 O b2 ，放热24.1 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O b2 经过渡态 R -T·OH • ·H 2 O b2 ，H 2 O辅助OH • 抽取H11，异构成 R -P * ·(H 2 O) 2 b2 。从 R -Cys·OH • ·H 2 O b2 到 R -T·OH • ·H 2 O b2 ，N5—H11和O15—H16分别从0.103 5、0.099 7 nm拉伸至0.136 2、0.144 4 nm，共价键断裂；O17—H18从0.097 6拉伸至0.107 6 nm，共价键减弱；C8—C1右视顺时针旋转7.3°， R -T·OH • ·H 2 O b2 产生了53.2 kJ/mol的内禀能垒。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 b2 吸热11.8 kJ/mol，解离成 R -P *b2 和(H 2 O) 2 。结构分析表明， R -P * b2 全同于 R -P *b1 ，因此在 图2 图2 未给出，记作 R -P *b2(b1) 或 R -P *b1(b2) 。从 图3 图3 可以看出，在b2通道修复 R -P *b2 的能垒为134.8 kJ/mol，此能垒远高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明Cys在b2通道的损伤难以修复。 从 图3 图3 可以看出，OH • 抽 α -H的最低能垒为12.5 kJ/mol，OH • 抽氨基H的最低能垒为4.6 kJ/mol，均远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明OH • 抽 α -H和氨基H诱导的Cys损伤容易发生。 2.1.3　c通道 3 此通道考察了H 2 O和(H 2 O) 2 辅助OH • 抽巯基氢2种情况。反应历程见 图4 图4 ，势能面见 图5 图5 。 1） OH • ·H 2 O抽氢。首先，OH • ·H 2 O与 R -Cys的H14和O9氢键作用，形成 R -Cys·OH • ·H 2 O c ，放热26.5 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O c 经过渡态 R -T·OH • ·H 2 O c ，抽H14，得到产物 R -P * ·(H 2 O) 2 c 。NPA电荷计算表明， R -P *c 与 R -Cys相比电荷分布发生显著变化， R -P *c 是 R -Cys损伤产物。从 R -Cys·OH • ·H 2 O c 到 R -T·OH • ·H 2 O c ，S13—H14从0.134 8拉伸至0.140 3 nm，BCP电荷密度 ρ 从0.325 0 a.u.减小至0.137 1 a.u.， <math id="M10"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 从-1.987 7变为-0.211 0，共价键减弱， R -T·OH • ·H 2 O c 产生的内禀能垒是7.3 kJ/mol。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 c 吸收21.2 kJ/mol的能量解离成 R -P *c 和(H 2 O) 2 。从 图5 图5 可看出， R -P *c 修复能垒为144.8 kJ/mol，此能垒远高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，Cys此情形下的损伤难修复。 2） OH • ·(H 2 O) 2 抽氢。首先，OH • ·(H 2 O) 2 与 R -Cys的H14和O9氢键作用，形成 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 c ，放热30.6 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 c 经过渡态 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 c ，抽H14，得到产物 R -P * ·(H 2 O) 3 c 。从 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 c 到 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 c ，S13—H14键的变化基本同于从 R -Cys·OH • ·H 2 O c 到 R -T·OH • ·H 2 O c ， R -T·OH • ·(H 2 O) 2 c 产生的内禀能垒为9.3 kJ/mol。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 c 吸收30.3 kJ/mol的能量解离成 R -P *c 和(H 2 O) 3 。从 图5 图5 可看出， R -P *c 在此情况下修复能垒为140.0 kJ/mol，Cys此情况下的损伤难修复。 从 图5 图5 可看出，OH • 抽巯基H原子反应的最低能垒为7.3 kJ/mol，该能垒远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明OH • 抽巯基H原子诱导的Cys损伤容易发生。 2.1.4　d通道 3 此通道分为抽H2和H4原子2个分通道，分别命名为d1和d2。反应历程见 图6 图6 ，势能面见 图7 图7 。 d1通道考察了OH • 、OH • ·H 2 O和OH • ·(H 2 O) 2 抽H2的3种情形。 1） OH • 抽H2。首先，OH • 与 R -Cys的H2和O10氢键作用，形成复合物 R -Cys·OH •d1 ，放热19.3 kJ/mol。然后， R -Cys·OH •d1 经过渡态 R -T·OH •d1 ，OH • 抽取H2，得到产物P * ·H 2 O d1 。NPA电荷计算及结构分析表明， R -P *d1 与 R -Cys相比较电荷分布发生了显著的变化，构型也有明显的变化， R -P *d1 是 R -Cys损伤严重的产物。从 R -Cys·OH •d1 到 R -T·OH •d1 ，C3—H2从0.108 8拉伸至0.116 3 nm，共价键减弱， R -T·OH •d1 产生了15.9 kJ/mol的内禀能垒。最后， R -P * ·H 2 O d1 吸收14.5 kJ/mol的能量解离成 R -P *d1 和H 2 O。从 图7 图7 可以看出， R -P *d1 修复的能垒为119.6 kJ/mol，此能垒高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] 许多，说明Cys在此情形的损伤也很难修复。 2）OH • ·H 2 O抽H2。首先，OH • ·H 2 O与H2和O10氢键作用，形成反应物 R -Cys·OH • ·H 2 O d1 ，此过程放热26.5 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O d1 经过渡态 R -T·OH • ·H 2 O d1 ，抽取H2，得到产物 R -P * ·(H 2 O) 2 d1 。从 R -Cys·OH • ·H 2 O d1 到 R -T·OH • ·H 2 O d1 ，C3—H2从0.108 7 nm拉伸至0.115 9 nm，BCP电荷密度 ρ 从0.281 5 a.u.减小至0.227 5 a.u.， <math id="M11"><msup><mrow><mo>∇</mo></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msup><mi>ρ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526382&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526367&type= 6.34999990 3.89466691 从-0.967 2变为-0.628 2，共价键减弱；二面角S13—C3—C1—N5从65.2°变为73.2°， R -T·OH • ·H 2 O d1 产生了12.7 kJ/mol的内禀能垒。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 d1 吸收20.6 kJ/mol的能量解离成 R -P *d1 和(H 2 O) 2 。从 图7 图7 可以看出， R -P *d1 修复的能垒为120.6 kJ/mol，此能垒明显高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，Cys在此情形的损伤也很难修复。 3） OH • ·(H 2 O) 2 抽H2。首先，OH • ·(H 2 O) 2 与H2和O10氢键作用，形成复合物 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 d1 ，此过程放热35.2 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 d1 经过渡态 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 d1 ，抽取H2，得到复合物 R -P * ·(H 2 O) 3 d1 。从 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 d1 到 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 d1 ，C3—H2从0.108 8 nm拉伸至0.116 0 nm，共价键减弱， R -T·OH • ·(H 2 O) 2 d1 产生的内禀能垒仅8.9 kJ/mol。最后， R -P * ·(H 2 O) 3 d1 吸收31.0 kJ/mol的能量解离成 R -P *d1 和(H 2 O) 3 。从 图7 图7 可看出，此情形下 R -P *d1 修复的能垒为117.9 kJ/mol，Cys在此情形的损伤也难修复。 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 d1 比 R -T·OH • ·H 2 O d1 产生的内禀能垒低了近30%，原因有三：一是 R -Cys·OH • ·(H 2 O) 2 d1 比 R -Cys·OH • ·H 2 O d1 的C3—H2键略长，红外振动频率较小，活化程度较高；二是 R -T·OH • ·(H 2 O) 2 d1 的C3—H2—O15—H16—O18—C8—C10成七元环；三是OH • ·(H 2 O) 2 抽H2比OH • ·H 2 O抽H2的反应物到过渡态二面角S13—C3—C1—N5改变小。 d2通道考察了OH • 和OH • ·H 2 O抽H4的2种情形，该通道与d1通道相似，只做一般讨论。 1) OH • 抽 α -H。首先，OH • 与 R -Cys的H4和O10氢键作用，形成 R -Cys·OH •d2 ，放热18.0 kJ/mol。然后 R -Cys·OH •d2 经过渡态T·OH • d2 ，OH • 抽取H4，得到产物P * ·H 2 O d2 。NPA电荷计算及结构分析表明， R -P *d2 是 R -Cys损伤的产物。从 R -Cys·OH •d2 到 R -T·OH •d2 ，C3—H4从0.108 9 nm拉伸至0.115 7 nm， R -T·OH •d2 产生了16.0 kJ/mol的内禀能垒。最后， R -P * ·H 2 O d2 吸收14.2 kJ/mol的能量解离成 R -P *d1 和(H 2 O) 2 。 2) OH • ·H 2 O抽H4。首先，OH • ·H 2 O与H4和O10氢键作用，形成 R -Cys·OH • ·H 2 O d2 ，此过程放热262 kJ/mol。然后， R -Cys·OH • ·H 2 O d2 经过渡态 R -T·OH • ·H 2 O d2 ，抽取H4，得到产物 R -P * ·(H 2 O) 2 d2 。从 R -Cys·OH • ·H 2 O d2 到 R -T·OH • ·H 2 O d2 ，C3—H4从0.108 9 nm拉伸至0.115 5 nm， R -T·OH • ·H 2 O d2 产生了8.9 kJ/mol的内禀能垒。最后， R -P * ·(H 2 O) 2 d2 吸收14.2 kJ/mol的能量解离成 R -P *d2 和(H 2 O) 2 。 从 图7 图7 可以看出，OH • 抽H2和H4反应的最低能垒分别为8.9、14.9 kJ/mol，均远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明OH • 抽亚甲基H原子诱导的Cys损伤容易发生。 2.2　加成过程 2 OH • 可以在纸面外和内两个方向加成到去质子羧基碳C8上，分别命名为e1和e2通道。 2.2.1　e1通道 3 OH • 在纸面外从距C8原子0.400 0 nm处（起点）开始攻击C8的通道e1，见 图8 图8 (a)，势能曲线见 图9 图9 (a)。 从 图9 图9 (a)可知，OH • 在纸面外攻击C8形成稳定加合物 R -P *e1 的过程无势垒，体系能量最低值为-334.3 kJ/mol。从 图8 图8 (a)可以看出，此时的C8—O15是0.142 0 nm（第258步）。对能量最低值对应的物种结构进行全优化，得到 R -P *e1 的C8—O15为0.142 1 nm。结构分析和NPA电荷计算表明， R -P *e1 与 R -Cys相比，构型和电荷分布都有很大变化， R -P * e1 是 R -Cys严重损伤的产物。从 图9 图9 (a)还可以看出，此时若OH • 继续攻击C8，体系的能量会急剧增加，需要外界给予能量。当C8—O15趋于0时，外界给予能量趋于无穷，说明分子间距不能为0。 2.2.2　e2通道 3 OH • 在纸面内侧从距C8原子0.400 0 nm处（起点）开始攻击C8的通道e2，见 图8 图8 (b)，势能曲线见 图9 图9 (b)。与e1通道相似，OH • 在纸面内侧攻击C8形成加合物 R -P * e2 的过程无势垒，体系能量最低值为-312.1 kJ/mol。对能量最低值对应的物种结构进行全优化，得到产物 R -P *e2 的C8—O15为0.135 9 nm。 R -P *e2 也是 R -Cys严重损伤的产物。 上述计算表明， R -P *e1 比 R -P * e2 的能量低2.7 kJ/mol，e2通道略具优势，加成损伤产物中 R -P *e1 比 R -P *e2 的分布略高。 2.3　单电子转移过程 2 单电子从 R -Cys向OH • 转移得到Cys + 和OH - 的过程见 图10 图10 ，Cys + 标记为 R -P *f 。 计算表明，产物和反应物的自由能之差 <math id="M12"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">o</mi></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526406&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526420&type= 9.39799976 3.97933316 是92.8 kJ/mol，重组能 λ 是77.6 kJ/mol，代入（1）式，计算得到能垒 <math id="M13"><mi mathvariant="normal">Δ</mi><msubsup><mrow><mi>G</mi></mrow><mrow><mi mathvariant="normal">S</mi><mi mathvariant="normal">E</mi><mi mathvariant="normal">T</mi></mrow><mrow><mo>≠</mo></mrow></msubsup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526424&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45526438&type= 9.39799976 3.97933316 为93.5 kJ/mol。该能垒略高于温和反应能垒83.6 kJ/mol [ 30 30 ] ，说明水液相下单电子从 R -Cys向OH • 转移反应进行的十分缓慢。NPA电荷计算表明， R -P *f 与 R -Cys的电荷分布有很大不同，见 图10 图10 ， R -P *f 是严重损伤的 R -Cys。 3　 结 语 1 在SMD/MN15/6-311++G(3df,2pd)//SMD/M06-2X/6-311+G(d,p)双水平研究了水液相下OH • 诱导的Cys分子损伤机理，得到如下结果：1) OH • 抽Cys的H、加成到去质子化羧基C和电子从Cys向其转移3个通道诱导Cys损伤；2) OH • 加成到羧基C的反应无势垒；羟基自由基水分子（簇）的抽H能垒在4.6~12.5 kJ/mol之间；电子从Cys向OH • 转移的能垒为93.5 kJ/mol；3) OH • 抽取 α -H、加成到羧基C及电子转移诱导的损伤严重。研究结果表明，水液相下OH • 可诱导Cys分子损伤，生命体补充Cys时，应采取措施使生命体减少产生OH • ；当生命体内OH • 过多时，也可以利用Cys予以清除。 参考文献 张礼 ， 孙堆 ， 王晓 ， 等 . 半胱氨酸参与生物体重金属抗性的研究进展 ［J］. 生物技术通报 ， 2017 ， 33 （ 5 ）： 26 - 33 . 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