基于氧化石墨烯及染料标记的核酸三色荧光探针检测汞离子 Detection of Mercury Ions Using Three-Color Fluorescent Probe Cooperated with Graphene Oxide and Dye-Labeled Nucleic Acids 1 2 first-author 李文恒，男，硕士生，现从事分子荧光光谱研究。E-mail：1272747496@qq.com 李文恒，男，硕士生，现从事分子荧光光谱研究。E-mail：1272747496@qq.com 1272747496@qq.com 1 2 1 2 1 2 1 2 corresp E-mail： zk3100@sohu.com E-mail： zk3100@sohu.com zk3100@sohu.com 1 2 corresp zk3100@sina.com zk3100@sina.com zk3100@sina.com 湖北民族大学 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000 湖北民族大学 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000 Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization， Hubei Minzu University， Enshi 445000， Hubei， China Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization， Hubei Minzu University， Enshi 445000， Hubei， China 湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施445000 湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施445000 School of Chemical and Environmental Engineering， Hubei Minzu University， Enshi 445000， Hubei， China School of Chemical and Environmental Engineering， Hubei Minzu University， Enshi 445000， Hubei， China 利用氧化石墨烯（GO）、两种荧光染料标记的单链DNA及核酸染料SYBR Green Ⅰ（SG-Ⅰ），构建了能特异性识别Hg 2+ 的三色荧光探针，建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子（Hg 2+ ）的新方法。在这种探针中，两种染料Tetramethyl-6-carboxyrhodamine （TAMRA）和Cyanine-5 （Cy-5）分别标记在两条单链DNA的5'端，这两条单链DNA中有一部分碱基互补配对，未互补的碱基均为胸腺嘧啶（T碱基）。在没有Hg 2+ 存在时，两种荧光染料标记的单链DNA被吸附在GO的表面，TAMRA和Cy-5与GO靠近，荧光被GO猝灭，它们的荧光信号都很弱；此时，SG-Ⅰ被吸附在GO的表面或游离在溶液中，荧光信号也很弱。在有Hg 2+ 存在时，两种荧光染料标记的单链DNA通过T-Hg 2+ -T结构特异性结合形成双链DNA，从而脱离GO的表面，TAMRA和Cy-5远离GO，荧光信号恢复；与此同时，SG-Ⅰ与双链DNA结合，荧光强度显著增强。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg 2+ 进行定量分析。在优化条件下，当Hg 2+ 的浓度在1.0×10 -9 ~5.0×10 -8 mol/L范围内时，TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度之和与汞离子的浓度具有良好的线性关系，方法的检出限（LOD）为1.1×10 -10 mol/L，实际水样的加标回收率在96.00%~105.00%之间。该方法用于实际水样中Hg 2+ 检测，获得了较为满意的结果。 A three-color fluorescent probe that can specifically recognize mercury ion (Hg 2+ ) was constructed using graphene oxide (GO), two fluorescent dyes labeled single-stranded DNA and nucleic acid dye SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ). A rapid, efficient and highly sensitive method for the quantitative detection of Hg 2+ in water was developed through the probe. In this probe, the dyes tetramethyl-6-carboxyrhodamine （TAMRA） and cyanine-5 (Cy-5) are labeled at the 5' end of two single-stranded DNA strands. Some of the bases in the two single-stranded DNA are complementary, and the uncomplementary bases are thymine. In the absence of Hg 2+ , dye-labeled single-stranded DNA was adsorbed on the surface of GO, and TAMRA and Cy-5 were close to GO. Their fluorescence was quenched by GO, and their fluorescence signals were weak. At this time, SG-Ⅰ was adsorbed on the surface of GO or dissociated in solution, and its fluorescence signal was weak. In the presence of Hg 2+ , different fluorescent dyes-labeled single-stranded DNA was specifically bound to form double-stranded DNA through the structure of T-Hg 2+ -T, which separated from the surface of GO, TAMRA and Cy-5 were far away from GO, and their fluorescence signals recovered. At the same time, the fluorescence intensity of SG-Ⅰ was significantly enhanced by binding with double-stranded DNA. Hg 2+ could be quantitatively analyzed according to the increase degree of fluorescence intensity of TAMRA, Cy-5 and SG-Ⅰ. Under the optimized conditions, there was a good linear relationship between the sum of fluorescence intensity of TAMRA, Cy-5 and SG-Ⅰ and the concentration of Hg 2+ in the range of 1.0×10 -9 -5.0×10 -8 mol/L, and the detection limit (LOD) of the method was 1.1×10 -10 mol/L. The recoveries of water samples are 96.00%-105.00%. The method was applied to the detection of Hg 2+ in actual water samples, and the satisfactory results were obtained. 汞离子 染料标记的核酸 三色荧光探针 同步荧光分析 mercury ion dye-labeled nucleic acids three-color fluorescent probe synchronous fluorescence analysis 0　 引 言 1 汞是毒性最大的重金属之一，不能被生物降解，而且可在生物体中积累。据报道，即使微量的汞也会对人体的肾脏 [ 1 1 ] 、肺 [ 2 2 ] 、胃肠道 [ 3 3 ] 和神经系统 [ 4 4 ~ 7 7 4~7 ] 造成损害。汞在自然界最稳定的存在形式是二价汞离子（Hg 2+ ），目前Hg 2+ 造成的汞污染仍然是人们严重关切的问题。目前，测定Hg 2+ 的方法主要包括原子荧光光谱 [ 8 8 ] 、气相色谱 [ 9 9 ] 、电感耦合等离子体质谱 [ 10 10 ， 11 11 ] 、原子吸收光谱 [ 12 12 ] 和冷气相汞分析 [ 13 13 ] ，或者几种方法联用 [ 14 14 ， 15 15 ] 等。在这些分析方法中，原子荧光光谱、电感耦合等离子体质谱及冷气相汞分析需要昂贵的实验装置，气相色谱需要较复杂的前处理过程，原子吸收光谱灵敏度不高且重复性差，均不适合Hg 2+ 的常规分析。分子荧光光谱法是利用荧光分子与目标物作用后，荧光信号发生显著变化来对目标物进行定性或者定量分析的方法，具有灵敏度高、检出限低、响应速度快、样品消耗少、信噪比高等优点 [ 16 16 ] ，已广泛应用于有机小分子 [ 17 17 ~ 19 19 17~19 ] 、有机大分子 [ 20 20 ] 及无机离子 [ 21 21 ~ 23 23 21~23 ] 等的分析与检测。 氧化石墨烯（GO）是一种亲水性物质，在水中有良好的分散性，由于其独特的物理和化学性质受到了广泛关注 [ 24 24 ] 。GO具有大的比表面和丰富的表面官能团，可利用π-π堆积作用对单链DNA（ssDNA）产生较强的吸附。另外，GO是一种良好的荧光共振能量转移（FRET）受体，能对荧光染料的荧光产生猝灭作用，且具有较宽的荧光猝灭范围 [ 25 25 ] ，已广泛应用于医学成像和生物传感器 [ 26 26 ] 等领域。相对于传统的有机猝灭基团而言，GO对荧光的猝灭效果更好，基于GO作猝灭剂建立的检测方法荧光背景信号及检出限均更低 [ 27 27 ， 28 28 ] 。 近年来，随着核酸技术的发展，基于核酸荧光探针在检测金属离子，特别是在有毒重金属方面得到了广泛的应用 [ 29 29 ~ 31 31 29~31 ] 。据报道，Hg 2+ 能与胸腺嘧啶（T碱基）形成稳定的T-Hg 2+ -T结构 [ 32 32 ] ，因此基于含T碱基的核酸荧光探针用于检测Hg 2+ 的方法引起了国内外科研工作者的关注 [ 33 33 ~ 35 35 33~35 ] 。这类方法选择性高，特异性强，共存离子对检测结果干扰小，检测结果准确可靠。但目前这些方法仍存在荧光信号单一，响应不灵敏等缺点。 本文基于GO、两种不同染料标记的富含T碱基的单链DNA，结合核酸染料SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ)，构建了能特异性识别Hg 2+ 的三色荧光探针，并建立了一种快速、高效、高灵敏地定量检测水体中Hg 2+ 的方法。与已报道的方法相比，该方法主要有两个优点：一是该方法利用GO超高的荧光猝灭效率以及多色荧光同时响应，在降低荧光背景信号的同时，显著提高了输出的响应信号，提高了检测方法的灵敏度，降低方法的检出限；二是3种染料（TAMRA、Cy-5和核酸染料SG-Ⅰ）的斯托克斯（Stokes）位移相差很小，3种染料的荧光信号可以通过同步荧光扫描法一次扫描同时获得，既节约了检测时间，也可以避免散射光对检测的干扰。 1　 实验部分 1 1.1　仪器与试剂 2 体系荧光光谱由RF-5301PC型荧光光谱仪（Shimadzu公司）采集，溶液pH值由PHS-3C型pH计（INESA公司）测定。 Hg(NO 3 ) 2 为优级纯，其余化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；核酸染料SG-Ⅰ购自上海瑞安生物技术有限公司；GO购自中科院成都有机化学研究所。TAMRA标记的含多个T碱基的单链DNA（PT）及Cy-5标记且与PT部分互补链（PC）均由上海生工生物技术有限公司合成，其核苷酸碱基序列如下： PT：5´-TAMRA-(CH 2 ) 6 -GTC TCG TTG GCT CCG TCG C-3´ PC：5´-Cy-5-(CH 2 ) 6 -GCG TCG GTG CCT ACG TGA C-3´ 自来水样取自湖北民族大学新校区工程实训中心实验室，天然矿泉水取自湖北省恩施市龙洞河，池塘水样取自湖北民族大学校园内池塘。自来水取样时，先放水5 min再进行取样，天然矿泉水和池塘水均使用聚四氟乙烯材质的简易采水器在水深20 cm处采集。采集完成后，水样带回实验室冷藏保存。 1.2　样品制备 2 将PT和PC用0.1 mol/L的Tris-HNO 3 缓冲溶液（pH 8.0，含60 mmol/L NaNO 3 ）配制成浓度为2.0×10 -7 mol/L的储备液。核酸染料SG-Ⅰ浓缩液用Tris-HNO 3 缓冲溶液稀释10 000倍得到SG-Ⅰ工作液，置于4 ℃条件下保存。Hg(NO 3 ) 2 用HNO 3 酸化的蒸馏水配制成不同浓度的溶液备用。分别取PT、PC储备液各50 μL置于离心管中，加入50 μL配制好的Hg(NO 3 ) 2 溶液，混合均匀，在35 ℃恒温反应12 min。向离心管中加入10 μL 0.5 mg/mL GO和50 μL SG-Ⅰ工作液，再补充缓冲溶液至总体积为500 μL，混合均匀，在室温下孵育5 min后转移至石英比色皿中进行荧光检测。所有实验中，除注明外，PT和PC浓度均为2.0×10 -8 mol/L，SG-Ⅰ加入量为50 μL，Hg 2+ 浓度为5.0×10 -8 mol/L。 1.3　实际水样的处理与检测 2 水样中的有机物及悬浮物易与汞结合，从而干扰汞的检测。因此，在检测之前需要对水样进行消解，以破坏有机物及悬浮物，使其释放出汞，便于汞的准确检测。具体步骤为：准确吸取20 mL预处理后的水样于消解罐中，加入约10 mL无汞蒸馏水，再依次加入1.5 mL浓H 2 SO 4 、1.5 mL HNO 3 溶液（1+1）、2 mL KMnO₄溶液（50 g/L）、2 mL K 2 S 2 O 8 溶液（50 g/L）。然后将消解罐置于沸水浴加热30 min，冷却至室温。在测定前，向消解液中缓慢加入盐酸羟胺溶液，边加边振荡，直至溶液透明，然后用0.45 μm滤膜过滤。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用1%的硝酸溶液定容，摇匀待测。 水样预处理完成后，将待测溶液按1.2方法处理，采用同步荧光分析法进行检测。为了使3种染料同时获得较好的荧光信号，检测时将同步荧光分析的波长间隔（∆ λ ）设置为22 nm，激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。 2　 结果与讨论 1 2.1　检测原理 2 基于GO及染料标记的核酸三色荧光探针定量检测Hg 2+ 的原理见 图1 图1 。两种荧光染料TAMRA和Cy-5分别标记在含有多个T碱基错配且部分互补的ssDNA的5'端（PT及PC）。在没有Hg 2+ 存在时，PT及PC通过π-π堆积作用被吸附在GO表面，TAMRA、Cy-5与GO靠近，其荧光通过FRET的方式被GO猝灭，荧光信号都很弱。此时，SG-Ⅰ被吸附在GO表面或游离在溶液中，荧光信号也很弱。当体系中存在Hg 2+ 时，PT及PC通过T-Hg 2+ -T结构特异性结合形成双链DNA，从而脱离GO的表面，TAMRA和Cy-5远离GO，其荧光信号恢复；与此同时，SG-Ⅰ与双链DNA结合，其荧光信号显著增强。 在该体系中，3种染料的Stokes位移（最大激发波长和最大发射波长之间的间隔）分别为Δ λ SG-Ⅰ =23 nm，Δ λ TAMRA =23 nm，Δ λ Cy-5 =21 nm，它们的Stokes位移很接近，但最大发射波长间隔距离较大（SG-Ⅰ、Cy-5及TAMRA的最大发射波长分别为525、580、672 nm），因此采用同步荧光分析法即可同时得到3种染料互不重叠的荧光信号。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg 2+ 进行定量分析。 2.2　方法可行性分析 2 图2 图2 展示了不同浓度Hg 2+ 对应的同步荧光光谱。结果表明，在没有Hg 2+ 的情况下，3种染料所对应的荧光信号都很弱；在Hg 2+ 存在的情况下，3种染料所对应的荧光信号都显著增强，且随着Hg 2+ 浓度的增大，荧光强度也呈比例增加。上述实验结果表明，本文所设计的三色荧光探针用于检测Hg 2+ 的方案是可行的。 2.3　GO浓度的选择 2 加入GO的目的是将未反应的PT和PC的荧光猝灭，GO的浓度会影响荧光猝灭的效果。因此，考察了不同浓度的GO对PT和PC的荧光猝灭情况，结果如 图3 图3 所示。当体系中Hg 2+ 浓度为5.0×10 -8 mol/L，PT和PC的浓度均为2.0×10 -8 mol/L，GO浓度在0~10 μg/mL时，TAMRA和Cy-5的荧光强度均随着GO浓度的增加而逐渐降低；当GO浓度大于10 μg/mL时，TAMRA和Cy-5的荧光强度都很弱，且荧光信号趋于稳定，说明此时TAMRA和Cy-5的荧光被完全猝灭。因此，本研究中GO浓度选择为10 μg/mL。 2.4　反应时间对检测结果的影响 2 PT、PC与Hg 2+ 之间的反应需要一定的时间，反应时间过短可能会造成PT、PC与Hg 2+ 之间结合不充分，反应时间过长可能会使DNA双链分解，也可能造成染料的荧光量子产率降低。考察了体系的反应时间对检测结果的影响。结果（ 图4 图4 ）表明，3种染料的荧光强度在3~12 min范围内随着反应时间的增加而增强，当反应时间继续增加时，3种染料的荧光强度均略有下降。因此，本实验最适宜的反应时间为12 min。 2.5　反应温度对检测结果的影响 2 温度能够影响PT、PC与Hg 2+ 的反应速率及双链DNA的存在形态。考察了体系的反应温度对检测结果的影响。结果（ 图5 图5 ）表明，当温度低于35 ℃时，3种染料的荧光强度均随着温度的升高而升高；当温度高于35 ℃时，3种染料的荧光强度均出现快速下降。这主要是因为温度较低时，温度的升高可以加快化学反应速率，但当温度超过35 ℃时，双链DNA发生裂解，导致荧光信号显著降低。因此，本实验选择的反应温度为35 ℃。 2.6　pH值对检测结果的影响 2 缓冲溶液的pH值会对检测结果产生影响，主要表现在：一是对PT、PC与Hg 2+ 之间的反应（形成双链DNA）产生影响；二是对3种染料的荧光量子产率产生影响；三是对Hg 2+ 的水解产生影响（Hg(OH) 2 的溶度积常数 K sp =3.0×10 -26 ，本实验中Hg 2+ 检测的最大浓度为5.0×10 -8 mol/L，在pH > 9.11时会产生沉淀）。考察了缓冲溶液的pH值对检测结果的影响。结果（ 图6 图6 ）表明，缓冲溶液的pH值在7.1~8.0之间时，3种染料的荧光强度均随着pH值的增大而增大；当缓冲溶液的pH > 8.0时，它们的荧光强度都随着pH值的增大而逐渐减小。因此，本实验选择缓冲溶液的pH值为8.0。在此条件下，PT、PC与Hg 2+ 既可形成较稳定的双链DNA，又不会产生沉淀，检测效果最好。 2.7　离子强度对检测结果的影响 2 由于单链DNA分子本身带有负电荷，溶液中离子强度的增加可以中和DNA表面的负电荷，有利于双链的形成。通过加入NaNO 3 改变体系的离子强度，结果（ 图7 图7 ）表明，NaNO 3 的浓度在0~60 mmol/L范围内时，随着NaNO 3 浓度的增加，3种染料的荧光强度都在增强；当NaNO 3 浓度继续增加时，3种染料的荧光强度趋于稳定。这主要是因为，在较低离子强度下，PT和PC表面都带有一定的负电荷，它们与Hg 2+ 反应速度相对较慢；随着离子强度的增加，PT和PC表面的负电荷逐渐被中和，有利于双链的形成，因此它们与Hg 2+ 的反应速率增加；而较高的离子强度使形成的DNA双链更稳定。因此，本实验选择的NaNO 3 浓度为60 mmol/L。 2.8　工作曲线及检出限 2 在最优实验条件下，考察了3种染料的荧光强度与Hg 2+ 浓度之间的关系。 图8 图8 (a)为不同Hg 2+ 浓度所对应的SG-Ⅰ、TAMRA与Cy-5的同步荧光光谱。结果表明，Hg 2+ 浓度在一定范围内，三种荧光染料的荧光强度均随着Hg 2+ 浓度的增加而增加。当Hg 2+ 的浓度在1.0×10 -9 ~5.0×10 -8 mol/L范围内时，3种染料SG-Ⅰ、TAMRA与Cy-5的荧光强度（ ΔF i = F i - F 0 ， F i 为样品的荧光强度， F 0 为空白对照的荧光强度）与Hg 2+ 浓度（ c ）之间均具有良好的线性关系，见 图8 图8 (b)(c)(d)，其拟合的回归方程分别为： ΔF 1 =16.43 c +0.45（ R 2 =0.995） ΔF 2 =17.72 c +7.74（ R 2 =0.990） ΔF 3 =19.55 c +42.21（ R 2 =0.998） 其检出限分别为3.0×10 -10 、3.5×10 -10 、2.7×10 -10 mol/L。另外， 图8 图8 (e)显示，3种染料荧光强度总的变化值( ΔF )与Hg 2+ 浓度之间同样具有良好的线性关系，其拟合的回归方程为 ΔF =55.19 c +37.39（ R 2 =0.999），检出限为1.1×10 -10 mol/L。从上述结果可以看出，利用3种染料总的荧光强度对Hg 2+ 进行定量检测，可以显著提高检测的灵敏度、降低方法的检出限。 2.9　方法的选择性 2 在优化的实验条件下，考察了水体中常见的金属离子（Ca 2+ 、Cu 2+ 、Zn 2+ 、Mg 2+ 、Ni 2+ 、Pb 2+ 、Co 2+ 和Cd 2+ ）对检测方法的影响。结果（ 图9 图9 ）表明，在Hg 2+ 浓度为5.0×10 -8 mol/L时，其他干扰离子浓度为1.0×10 -5 mol/L 时，Hg 2+ 所对应的3种染料的荧光强度仍远大于干扰离子的荧光强度，且干扰离子对应的荧光强度趋近于空白溶液对应的荧光强度。这说明在相同实验条件下，水中常见的金属离子对Hg 2+ 的检测几乎没有干扰，即本方法具有良好的选择性。 2.10　实际样品检测 2 为了检验本方法在实际样品检测中的应用效果，对实际水样中的Hg 2+ 进行检测，并通过加标回收实验对方法的准确性进行评价。在自来水(T1~T4)、河水(R1~R4)和池塘水(P1~P4) 3种不同的水样中，分别添加不同浓度的Hg 2+ ，消解后，再利用本方法对Hg 2+ 的浓度进行测定，并计算加标回收率，结果如 表1 表1 所示。自来水、河水和池塘水中Hg 2+ 浓度分别为1.03、1.81、1.08 nmol/L，均低于国家规定的饮用水中汞含量的标准值0.001 mg/L（4.99 nmol/L）。所有样品检测结果的相对标准偏差（RSD）均在5%以内，表明该方法的重复性较好；所有样品的加标回收率都保持在96.00%~105.00%之间，说明利用该方法进行Hg 2+ 检测得到的数据准确度高、可靠性强，能够实现对实际水样中Hg 2+ 的准确检测。 样品序号 加入量/(nmol/L) 实测值/(nmol/L) RSD/% 回收率/% T1 0.00 1.03 0.12 — T2 0.40 1.44 0.61 102.50 T3 4.00 5.16 3.92 103.25 T4 40.00 40.90 0.73 99.68 R1 0.00 1.81 3.33 — R2 0.40 2.23 4.52 105.00 R3 4.00 5.65 1.84 96.00 R4 40.00 41.72 1.51 99.78 P1 0.00 1.08 2.73 — P2 0.40 1.47 2.72 97.50 P3 4.00 5.10 3.64 100.50 P4 40.00 41.10 0.72 100.05 3　 结 语 1 本实验基于GO及两种荧光染料分别标记的单链DNA，结合核酸染料SG-Ⅰ，构建了一种能特异性识别Hg 2+ 的三色荧光探针，并利用该探针建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子（Hg 2+ ）的新方法。该方法操作简单，灵敏度高，重复性及选择性好，准确度高，能应用于实际水样中Hg 2+ 的定量检测。 参考文献 YAO X ， STEVEN XU X ， YANG Y N ， et al . 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